在模块化、高通量和灵活的诊断 SARS-CoV-2 RT-qPCR 工作流程中准确分配 RNA spike-in 对照

Biogazelle 是一家合同研究组织 (CRO)，专门从事支持药物研究、临床试验和诊断测试开发的高价值应用。为了加速包括小分子、RNA 靶向药物和过继细胞疗法在内的疗法开发，他们使用了一套基因组和转录组学技术。Biogazelle 在对液体活检和福尔马林固定石蜡包埋组织等珍贵临床样本应用定量 PCR、数字 PCR 和专用 RNA 测序工作流程方面处于独特的前沿地位。

2020年4月，他们引入了高通量、模块化和可扩展的 SARS-CoV-2 RT-qPCR 检测平台，每天可处理多达 6000 个患者样本。诊断测试使用ISO17025 质量管理体系运行。

除了外部“全过程”质量控制样品（即经历从样品初次转移到RNA提取到 RT-qPCR的整个工作流程的阳性和阴性样品），也使用了运用专有体外转录非人类 RNA的内部RNA spike-in 对照。

该对照验证了提取正确的纯 RNA，不含RT-qPCR 抑制剂。将少量(4 μL) spike-in对照精确、准确地添加到每个患者的裂解液中。由于每天需要在数十个96孔板上进行此操作，因此自动化就显得尤为必要。

图1: MANTIS® 液体处理器。

Biogazelle 选择 FORMULATRIX® MANTIS® 液体处理器（图 1）作为其诊断 SARS-CoV-2 RT-qPCR 测试中的自动分液系统，是因为Mantis占地面积小、灵活和高速准确分液的特性。但是，在质量控制过程中引入和使用仪器之前，必须根据具有特定验收标准的预定义方案对仪器进行验证。

Biogazelle 着手验证 MANTIS 是否满足两个关键要求：

•  快速、准确和精确地分配小体积液体。

•  在满足第一点的前提下，且不会在相邻孔中引入飞溅物，导致交叉污染。

后一个标准在 SARS-CoV-2 病毒诊断中至关重要，因为患者样本可能含有每毫升超过 10 亿个病毒载量的运输介质。在这种情况下，即使是 10 皮升（喷墨打印机墨点的大小）的微小液滴仍 会含有 10 多个病毒载量，这足以产生假阳性结果。

MANTIS取芯、充注、96孔分液、芯片重新定位和机械臂归位的时间不到 90 秒，其绝对符合速度标准。之后又使用两个功能性定量 PCR 测试验证了它的准确性和精密度。

在第一次测试中，MANTIS 将 8 μL 高浓度DNA寡核苷酸标准溶液输送到 17 μL 预混液（包括引物和 PCR 混合物）中。然后使用校准的电子重复移液器手动分配到 96 孔板的每个孔中。在板密封、涡旋和离心之后，将 5 μL液体 一式四份转移到384 孔 qPCR 板的每个孔中。然后在 qPCR 机器上进行循环并导出数据（图 2）。

图 2: 由 MANTIS® 制备的 4 x 96 反应的 Sigmoidal qPCR 扩增曲线。

然后将数据导入到 Biogazelle 开发用于 qPCR 仪器功能验证的免费网络应用程序中，并略加改变以验证 MANTIS 的精度。Biogazelle博客上提供了有关 Web 应用程序的更多信息 。该软件的结果显示出MANTIS出色的精度，没有缺失值，384 个 Cq 值的标准偏差为 0.133，0.5 个循环内所有数据点的重复性为 99.5%（图 3）。

图 3: 图 2 中的数据由 Biogazelle 的免费网络应用程序处理，在预定的验收标准内展示了出色的精度。

在第二个测试中，在一块96 孔板中加入5 μL 人类基因组 DNA ，分为12个区间在11.54 到 60 ng/μL 之间的不同浓度（列），同等复制8份（行），然后用MANTIS 添加18.08 至 115 μL 范围体积的无核酸酶水对前者进行标准化处理。所得 DNA 源板含有 2.5 ng/μL 浓度的DNA，其中 2 μL一式四份添加到 384 孔板中的 5 μL SYBR Green I qPCR 中。使用上述网络应用程序分析了 qPCR 数据，证明了 MANTIS 完美的浓度标准化，反映在其出色的精密度和准确度上：没有丢失 qPCR 数据，所有 384 个 qPCR 数据点的标准偏差为 0.144，0.5 个循环内的所有数据点的重复性为 99% 。

最后，为了评估MANTIS高速微滴分液不会引入可能导致交叉污染的气溶胶或飞溅物，进行了最终验证实验。在这次实验中，使用MANTIS将 4μL 的 RNA spike-in 分配到96 深孔微量滴定板中，板中装有 200 μL 无核酸酶水或每微升500 万病毒载量的 DNA 寡核苷酸溶液。

图 4: 没有证据表明 MANTIS® 引入了交叉污染。使用 MANTIS® 处理的高浓度（500 万病毒载量/μL）源板中的2 μL 液体，得出的重复 qPCR 数据的384 孔板视图。空孔表示没有 qPCR 信号；其他孔显示观察到的 Cq 值。

含有寡核苷酸溶液的 18 个孔以棋盘状模式定位，其中每个含有寡核苷酸的孔被 8 个不含标准分子的纯水孔包围。在 384 孔板中的 5 μL SYBR Green I 反应中，所有 96 孔中的 2 μL 溶液的qPCR读数一式两份（在所有交替行中具有额外的阴性对照反应），证实在与诊断工作流程非常相似的实验条件下使用MANTIS完全不会引起交叉污染（图 4）。

基于这些验证实验，我们发现 MANTIS 适用于在 96 孔板中精确、准确和无交叉污染分配小固定体积液体，能够作为诊断 qPCR 工作流程的一部分。同时，通过分配足够体积的水以获得相似的最终浓度，MANTIS 被验证能用于标准化 96 孔板中的核酸样品或测序文库。

FORMULATRIX 感谢 Biogazelle 团队分享他们的验证工作流程和数据。 Biogazelle 提供的网络研讨会可在 FORMULATRIX 网站上查看。