检测乙型肝炎抗原的HTRF®检测方法的开发

用户--Cisbio

应用说明

此展示材料分享了与 FORMULATRIX® 公司合作使用 MANTIS® 液体处理器开发用于检测乙型肝炎“e”抗原 (HBeAg) 重组蛋白的 HTRF® 检测方法。使用 MANTIS® 提高了工作流程的效率，能够分析更多条件，同时节省时间和试剂成本，而且还可以获得可重现、无错误的结果。与传统分液方法相比，MANTIS® 液体处理器使 Cisbio公司能够更快地完成所有检测开发步骤（即最佳配对分析、偶联物优化等）。

MANTIS® 液体处理器可自动分配低至 100 nL 的微流体液体，从而实现高效且可重复的分析优化。MANTIS® 能够将不同微孔板中的小体积液体分配到任何反应孔中，这使研究人员能够根据任何 384 孔或 1536 孔微孔板中的浓度和体积梯度评估分析性能。再加上MANTIS小于 3% 的 CV 和 6 µL 的死体积，这些功能使 MANTIS® 成为快速有效地发现 HTRF® 检测最佳条件的理想解决方案。

重组蛋白和最佳配对抗体的选择

12 种市售抗体用 HTRF® 染料标记并偶联成 36 对配对抗体，以评估它们检测重组蛋白 HBeAg 的能力。对来自 2 个供应商的重组蛋白 (rProtein) 进行了 3 种不同浓度（500、50、5 ng/mL）的测试，以找到最适合我们检测的一种。来自供应商 1 的重组蛋白没有显示相关信号，因此在本研究的下一步中没有对其进行进一步研究。

当使用供应商 2 的 重组蛋白 进行测试时，13 对配对抗体显示出明显的信号（图 1）。其中，前 4 对配对被选择用于下一个检测开发步骤 - 抗体配对优化（图2）。

抗体配对优化

MANTIS® 允许同时研究多种抗体，考虑到这一点，我们选择研究 12 对配对抗体。在这里，我们使用该系统在一个步骤中优化每个选定的配对。配对1+6、9+12、9+6 和 11+10 使用以下配置进行优化：抗体供体 (D) 和抗体受体 (A) 在矩阵方法中以 3 种不同浓度进行测试。重组蛋白浓度一开始为2000 ng/mL，然后进行 2 倍稀释。重组蛋白和抗体以 16:2:2 形式（16uL 重组蛋白，每种抗体 2uL）分配在白色小体积 384 孔板中。从选择的 4 个潜在配对中选出了 2 个最佳配对。这两对配对是动态范围（1+6；图 3.A）和灵敏度 （9+12；图 3.B）之间综合的最佳者。

培养基的影响

进行以下实验以评估细胞培养基对 2 对选定的配对抗体1+6 和 9+12 的影响。两对均以 500 ng/mL 的浓度开始进行测试，然后在稀释剂、RPMI 或 DMEM 中稀释2 倍。重组蛋白稀释液和抗体以 16:2:2 形式（16uL 裂解物，每种抗体 2uL）分配在白色小体积 384 孔板中。当在配对 1+6 的测定中使用 RPMI 时，观察结果显示培养基的影响甚微，而 使用DMEM时显示培养基的影响比较大。当细胞培养基用于配对 9+12 时，观察显示培养基影响很小。虽然这对配对表达的信号比较低，但它被选为检测乙型肝炎“e”抗原重组蛋白的最佳配对抗体，是因为它比配对 1+6 具有更好的灵敏度。

检测重现性

评估该检测的重现性并绘制标准曲线以研究其动态范围。对于该实验，在室温下将不同浓度的重组蛋白与抗体配对 9+12 一起过夜培养（图 5）。

该测定显示出良好的重现性并表现出以下特性：

动态范围：0.5 ng/mL 至 125 ng/mL

LOQ* = 0.5 ng/mL

LOD** = 0.193 ng/mL

*LOQ：定量限（基于 20% DF 时的信号）

**LOD：检测限（基于 30 次重复的 Std 0 均值 + 2 SD）

总结

事实证明，Formulatrix® 的 MANTIS® 液体处理器是一台高效的分液仪，它可以同时处理多个实验条件并快速开发和优化 HTRF® 分析。从大量选择项（2 种重组蛋白、36对配对抗体、2 种细胞培养基条件）中成功识别和优化了使用该分液仪得到的测定参数，而这些参数构成了灵敏且可重现的 HTRF® 检测。