【应用干货】利用新型微流体试剂分配技术对大豆进行高通量大规模基因分型

介绍: 

DNA标记/QTL（基因）发现和标记检测技术的最新进展对通过标记辅助选择对作物改良具有重大影响。为了在植物育种中发现和利用DNA标记，建立低成本、高通量、大规模、可靠和灵活的标记基因分型平台是关键因素之一。为SNP基因分型平台（如TaqMan和KASP分析）实施高通量工作流程需要准确分配检测预混液和试剂。速度和准确性是实现所需检测性能的关键因素，同时利用使试剂使用最小化的工作流程以进行大规模研究。 

在此，我们展示了MANTIS仪器在我们的大豆计划中的DNA标记/QTL发现和分子育种过程中的应用。

材料: 

MANTIS是一款易于编程、低容量、低死体积、非接触式的试剂分配器。MANTIS可以配置多达（6）种不同的试剂，分配范围为100 nL - 2 mL，可以将任何体积的试剂分配到任何孔中，并与任何密度高达1536的平板兼容。

为了尽量减少死体积，试剂可以直接插入微流控芯片。通过使用移液器吸头作为加样槽，死体积可以进一步减少到6μL。这一功能非常适合分配昂贵的PCR试剂。

MANTIS®的核心是一个获得专利的微流体阀组，用于测量和分配离散体积液体。压力和真空打开和关闭硅阀组上的每个阀门。每个芯片都有两个微型隔膜（100纳升/500纳升或1微升/5微升），可以以每秒10次的速度填充和分配。Mantis的整个流体路径是一次性的，以消除交叉污染风险。

MANTIS®软件提供了一个易于使用、用户友好的方式来设计和运行您的检测。只需将试剂添加到分配列表中，定义体积，并在虚拟板上点选以定义您希望试剂分配的位置。MANTIS软件能够设计梯度和回填，此外还能够导入.txt和.csv的分配列表。

方法: 

从CX1512-44来源分离FAD3A和FAD3C基因的两个BC1F2种群。从温室种植的幼苗或田间种植的植物中收集叶子样品并排列在96孔板中。将叶样品在550°C下干燥24小时，并在管中使用带有单个BB(Daisy，Rogers AK)的GenoGrinder以1600rpm研磨2分钟。然 后从叶粉中提取DNA。

TaqMan分析引物和探针使用Primer Express 3.0.1软件设计，以检测FAD3A和FAD3C (CX1512-44) 中的突变SNP。所有检测均由一对引物对扩增范围为141-167 bp的扩增子和两个分别用VIC(野生型)和FAM(突变型)染料标记的含SNP的探针组成。

PCR反应在4.0µL的反应系统中进行，其中含有2µL样品DNA、2µL2×TaqMan Universal预混液(Life Technologies, Carlsbad CA)和0.2µL 5×分析混合物(每种引物的终浓度为0.255µM，每个探针的终浓度为0.05µM)。使用Mantis试剂分配器将预混液和分析混合物分配到含有样品的384孔板中。

PCR后，用Tecan M1000 Pro Infinite Reader(Tecan Group Ltd，Morrisville NC)读取孔板，并将输出文件导入Kluster Caller 软件，以实现集群的可视化和SNP调用。

结论: 

大豆种子油的成分，特别是棕榈酸、油酸和亚麻酸，由于其营养的重要性和工业应用，对消费者来说具有巨大的利益。培育高油酸和低亚麻酸的大豆栽培品种成为重要的育种目标之一。我们开发的用于选择某些来源的有利油脂成分的SNP TaqMan标记检测在分离野生型、突变体和杂合子方面非常有效。在基因分型过程中，借助于Mantis试剂分配器，我们建立了这个基因分型工作流程，它是准确、高效和具有成本效益的。因此，该检测方法已被广泛应用于大豆育种项目，以促进脂肪酸性状的标记辅助选择，并提高了效率和精度。