作为LAUDA产品经理的我将要和大家介绍一下LAUDA这个产品作为百搭款仪器在实验室充分贯彻的合作共赢精神以及它在各个行业领域为科学事业做出的贡献  。       如果你的实验室需要用到精确的温度控制，那Lauda一定是最适宜的选择，不论您是哪个行业，哪个领域。目前Lauda的产品在食品，药品，汽车零配件，石油石化，航空航天，半导体领域，大学实验室，研究所等各种高端实验室都可以见到。这得益于Lauda全系列完美的温度控制技术以及Lauda在全球范围内品牌的影响力。 Lauda的各种配套1、反应釜配套  ECO系列配合小型的反应釜（温度在－50至200℃具有极高稳定性） XT系列高级型工艺恒温控制器和大型反应釜配合（满足动态温度控制，极宽的温度变化范围） RP 4090C配合AG！定制型反应釜（大旋）（高性能制冷恒温器，温度范围-90至200℃） 2、晶体生长控制配套RM6 S/H配套AIXTRON的MOCVD气相外延生长，物理法控制晶型（高精度的温度控制±0.05K，有效控制晶体生长）Proline Kryomats配套结晶器对晶体生长做精确控制,物理法和化学法结合。（从实验室型结晶器到大型中试结晶器，温度－90至200℃，精确度±0.05K）3、旋转蒸发配套MC350可以最多同时供应2台2到3liter的旋蒸同时使用。将风冷却进行分路调节，并节约实验室用水。超高性价比的RA8和IKA旋转蒸发配合冷凝。4、粘度流变配套RE 1050S 配套博勒飞的高端流变仪(温度范围－50至200℃，温度稳定性±0.02K)5、其他相关配套RA8和显微熔点仪 Loop配套旋光仪折光仪分光光度计进行温度控制（超高性价比，4至80℃温度控制，精确稳定安静） Lauda还配套应用在:   发酵罐的温度控制    膜蛋白结晶   医疗血清水浴控温   啤酒保质期测试   应力测试   冻干实验   激光分选   凯氏定氮   各类光谱仪   电焊设备   注塑机   中央冷却水供应   数字打印   激光切割   盾构机   温度校验……Lauda可以提供全系列完美的温度控制，选型的时候一般考虑的是科技工作者的配套设备，使用温度范围，使用环境等相关需求。配套就是合作，合作才能peace and love.我发现hip-hop的精神和lauda的吻合程度完全可以相提并论。这也是我在这个领域里找到和我算是比较搭的地方。Lauda 在各领域中的应用研究和开发实验室       在研发领域，温度控制对于样品前处理和质量控制都极为重要。作为样品制备的一部分，在很多应用中都需要提前进行温度处理。许多的质控过程需要样品在已定义的温度点或者一个特定时间内温度变化的条件下进行。      典型应用       ? 样品制备       ? 质量控制       ? 研究实验室 汽车领域        汽车行业对于温度控制的要求一般在测试台架和材料测试环节。所有汽车的零部件都会在极高的温度波动条件下使用。在特殊的台架上测试零部件尤为重要。无论是低温还是高温，对于材料使用的环境条件进行模拟也非常重要。       典型应用       ? 测试台架应用       ? 材料测试   生物科技        在生物科技中，温度的控制决定了研发和生产成果的质量。生物反应器的恒温控制对于成功的生产起到至关重要的作用。作为样品制备的组成部分，有很多的生产步骤需要可靠的温度控制。       典型应用        ? 样品制备        ? 生物反应器 化学领域      在化学领域的诸多工艺过程中，温度在工艺工程、反应釜温度控制方面都扮演了非常重要的角色。化学反应、合成、药物基本组分的生产、聚合和结晶都是在有温度控制的反应釜中进行的。      典型应用      ? 反应釜温度控制      ? 工艺工程 制药工业      在制药领域，温度控制过程遍布于研究到生产放大的各环节。为了得到高质量的反应产品，温度控制系统需要对外部的反应釜进行稳定可靠的工艺过程温度控制。      典型应用      ? 反应釜温度控制      ? 工艺工程  半导体工业领域       在半导体生产和电子器件的测试中，需要精确温度控制的过程比比皆是。这其中包括，例如，金属有机化合物化学气相淀积(MOCVD)在生产LED晶片的镀膜过程中的应用。其它半导体行业的典型应用比如功能应力测试和负载测试、环境条件模拟和在线集成电路性能测试等。      典型应用       ? 过程冷却       ? 元件测试 航空领域       温度模拟和材料的温度测试是航空航天领域非常重要的组成部分。循环温度变化应力测试确保了所使用的零部件没有任何的故障，即使在太空中极端的外部条件波动下。典型应用      ? 材料测试      ? 温度模拟 医疗技术领域       在医疗技术领域， 温度控制主要应用在实验室的样品制备；以及制药和医疗实验室中的医疗设备如成像设备、医疗激光器或设备中。      典型应用      ? 医疗实验室      ? 医疗设备            只要您需要温度控制，那lauda必定会有适合您的款。不是因为我们是均码，而是我们从1956年成立至今，62年的经验积累和专业技术、独创性决不妥协的产品质量，让我们能够在各行各业提供专业的解决方案。

【Webinar预告】       针对HCP这个热点问题，GE生命科学非常荣幸地邀请到位于美国新泽西Kenilworth的默克公司（在中国称为“默沙东”）的Fengqiang Wang（王凤强）博士，来共同探讨使用ELISA检测残留宿主蛋白所面临的挑战，以及使用何种方法才能获得更好的ELISA抗体覆盖率方面的问题。       详情请长按下方二维码进入GE生命科学查看详细信息。点此进入【HCP检测及覆盖率的验证介绍视频】【什么是宿主细胞蛋白？】       生物药物（或生物制剂）一般通过微生物，植物或动物细胞等生命系统生产。有些细胞系，例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，也可以被作为细胞工厂，让其除了制造自己的生物分子外，还可以生产其他生物制剂。       宿主细胞蛋白（HCP）就是这些细胞工厂的有效生物副产物。 它们是收获的细胞培养液（HCCF）中的主要杂质之一，并且更容易在细胞死亡或受损时释放，而并不是通过活性分泌释放。 HCP可影响药物的功效和毒性，如果在制造过程中没有除去，则具有长期免疫原性。       实际上，包括美国和欧盟在内的全球药典都包含用于检测HCP和纯化生物药物的监管指南。今天，就让我们仔细看看和分析科学家是如何来测量宿主细胞蛋白（HCP），以及使酶联免疫吸附测定（ELISA）成为黄金标准的原因。【HCPs与工艺开发】       任何新生物制剂的工艺开发的都必须经过检测HCP的特定组合并确认已在纯化过程中将它们降低到安全水平，通常控制在每毫克药物残留纳克级HCPs的范围内【1】。       正如您知道的那样，有许多因素会影响HCP的检测。首先，由于每个宿主细胞系都具有其自身独特的表达蛋白质特征。其次，即使在同一细胞系中，上游培养条件的任何差异包括温度，酸度，营养供应等，都会影响HCP组合和丰度的准确性，这也就导致您在上游进行的任何更改都可能对HCP产生下游影响。      因此，作为工艺开发的一部分，您可能需要在各个点调整和优化下游纯化步骤，例如，在蛋白A亲和层析和离子交换层析之后（图1）。      为了减少HCP，一个可靠且准确的分析方法对于检查和调整每个纯化步骤至关重要： 这个答案就是夹心ELISA。其测定的灵敏度和选择性使其非常适合检测HCP群体的复杂混合物，而且易于操作和自动化，并且可以高通量进行。图1，ELISA 在每一步生物制药工艺开发阶段都是不可或缺的【ELISAs如何用于测量生物制剂生产中的HCP？】       HCP分析中的任何测定有3种类型：检测，定量和鉴定（USP 1132）。 ELISAs使检测和定量变得简单，而如质谱这种正交分析可以在需要时进行鉴定使用。      ELISA的原理是抗体对其靶抗原的亲和力和选择性，在这种情况下抗体即是HCPs。检测HCP的存在和丰度遵循夹心ELISA方案（图2），通常每次测定均使用单一抗体。但是，鉴于HCP不仅仅是一个个体，而是多种复杂的群体，在一次多分析物检测中，您可能需要多种多克隆抗体来对抗复杂的HCP抗原群体。过程通常包括：     1，用模拟或空表达盒培养空载细胞系。     2，用HCP免疫合适的动物宿主，例如兔，山羊或鸡。     3，提取宿主产生的抗体，通过2D凝胶电泳/ Western印迹检查抗原的覆 盖率。     4，生物制药公司也可能会使用商业上可用的通用试剂盒进行这些检测，和/或开发流程或平台特定的方法（USP 1132和Ph.Eur。2.06.34），具体取决于需求，开发阶段和成本。图2，一个典型针对HCP的夹心ELISA实验【覆盖率不全面怎么办？】       尽管是基准测定，但ELISAs无法检测到所有内含物。即使采用特定工艺方法，您也不可能使用增加的抗体100％覆盖所有HCP。一些HCP不具有足够的免疫原性以在动物宿主中引发反应，或者仅引发低反应。任何对抗原具有低亲和力的抗体都可能无法用ELISA检测到！      因此，为了确保使用ELISA对进行HCP定量的准确性，监管机构要求对每个实验进行验证。在许多方案中都会使用到跑2D凝胶电泳/蛋白质印迹并将抗HCP抗体检测与凝胶内总蛋白质染色进行比较。这种类型的覆盖分析使您能够预估百分比覆盖率，并可以指导您使用更具体的ELISA或正交分析，如质谱分析来填补这一空白。      2016年和2017年美国和欧盟药典的更新显示了检查覆盖面越来越重要（USP 1132和Ph.Eur.2.06.34）。关于同一主题的日本药典也正在准备中。     虽然这些更新只是指南和最适宜实践，但大多数分析科学家现在认为覆盖率测定是产品开发的重要组成部分。【相关产品】DIBE套装 用于ELISA试剂盒覆盖率检测GE® Amersham Typhoon™ 5 全功能激光扫描成像仪Melanie™ Coverage HCP 覆盖率分析软件GE® Ettan™ IPGphor 3 等电聚焦电泳仪GE® SE600 垂直电泳仪GE® TE77 PWR 半干转印仪 ELISA的检测及自动化BioTek® Synergy™ Neo 2 多功能酶标仪BioTek® Precision™ 自  动化微孔板移液分液系统BioTek® Biostack™ 微孔板储板器参考文献【1】The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnol Bioeng. 2015 Sep;112(9):1727-37. doi: 10.1002/bit.25628. Epub 2015 Jul 14.欲了解更多信息，请联系德泉兴业：010－83834948

       划痕实验（Wound Healing)是一种操作简便的研究肿瘤迁移/损伤愈合的体外试验方法。使用枪头垂直对准96孔板的下端中央部位，向上轻推即可形成划痕。然而，看似简单的划痕操作，却让很多实验人员倍感头疼：重复劳动量太大，累到手抖划痕结果均一性很差，重复性低             BioTek新推出的全自动划痕器—AutoScratch™，让您从容面对划痕实验。● 自动产生划痕，确保优异的均一性● 兼容24和96孔板● 全自动清洁程序● 划痕针更换便捷快速● 操作便捷无需额外培训       AutoScratch™工作视频展示：视频一http://t.cn/EUkVbz0?m=4318511683484770&u=3178376470视频二http://t.cn/EUkV6S2?m=4318511818595546&u=3178376470       配合BioTek旗下的Cytation™/Lionheart™全自动活细胞成像系统和Gen5软件，可自动化给出细胞生长变化图像、视频、数据及动态曲线。Gen5软件自动拍照并识别划痕边缘Gen5软件自动计算出划痕宽度变化曲线配合产品推荐※长按识别二维码，查看详细产品信息欲了解更多信息，请联系德泉兴业：010－83834948

PD-1单抗药已经上市，但PD-1蛋白层面的调节机制并不清楚，此次整理分享的文章研究了PD-1降解机制：内化、泛素化、蛋白酶体降解，FBXO38在PD-1降解过程中发挥重要作用，具体内容如下：三种不同T细胞（人 CD8 T cell、小鼠CD8 T cell、Jurkat cell）PD-1表达水平-时间变化曲线：激活后的T细胞2天PD-1表达到峰值，之后开始降解还是那三种细胞，蛋白水平看激活后2天PD-1表达开始降低，但转录层面变化不明显IP实验发现PD-1和泛素相互作用，暗示PD-1被泛素化PD-1胞内段有泛素化位点（210Lys和233Lys），共聚焦显微镜观察到了PD-1内化、降解过程蛋白酶体抑制剂MG132可抑制PD-1的降解，溶酶体抑制剂NH4Cl则不能，这个数据也暗示PD-1降解是由蛋白酶体参与的泛素化调节的在Jurkat细胞上表达GST-PD-1，用PD-1“钓”蛋白（质谱表征），找调节PD-1泛素化的E3连接酶：钓到了100多个蛋白（上图只截取了部分），比对文献，其中FBXO系列蛋白属于E3泛素连接酶基于质谱大数据，再用IP实验验证：PD-1和FBXO38存在相互作用在细胞上表达FBXO38会降低PD-1的表达（FBXO47则无此效果，暗示FBXO38对PD-1表达调节的特异性；另外FBXO38的表达对TCR的表达不产生影响）敲低FBXO38，PD-1表达升高（TCR表达不受影响），结合上面的数据，说明FBXO38是调节PD-1降解的E3泛素化连接酶       再次验证：只有同时表达PD-1和FBXO38才可观察到PD-1泛素化；调高FBXO38，PD-1泛素化升高，调低则泛素化降低时间维度再看一下FBXO38对PD-1降解的调节特异性的敲除T细胞上FBXO38后，T细胞的发育、稳态、记忆不受影响特异性KO T细胞FBXO38不影响T细胞激活、增殖、凋亡，也不影响疲劳markerLAG-3的表达KO FBXO38使T细胞（包括Treg）PD-1表达升高敲除FBXO38的小鼠种瘤之后肿瘤生长更快、小鼠存活时间缩短检测肿瘤浸润T细胞：敲除FBXO38并不影响T细胞对肿瘤的浸润，且不影响T细胞对肿瘤细胞的识别（CD44阳性细胞比例未发生变化） 检测肿瘤浸润T细胞：敲除FBXO38后，CD4和CD8T细胞PD-1表达升高（Treg细胞PD-1表达无差异），效应分子（颗粒酶、干扰素、肿瘤坏死因子）阳性CD8T细胞比例降低，CD8T细胞增殖能力降低PD-1抗体抑瘤作用可在FBXO38细胞缺陷的小鼠上发挥，作用和野生型小鼠没有差异前面的数据说明了FBXO38对PD-1的调节作用，初步研究了FBXO38对于肿瘤免疫的调节作用，进一步研究FBXO38对肿瘤免疫的调节作用：用RNAi技术敲低FBXO38，敲低后TCR和CD28的表达不受影响FBXO38被敲低后，CD8T细胞的激活、细胞因子生成不受影响In vitro：FBXO38被敲低后PD-1表达升高，CTL杀伤肿瘤细胞的能力减弱，PD-1抗体可rescueFBXO38敲低引起的杀伤能力减弱In vivo看FBXO38敲低对肿瘤免疫的影响：敲低后CD8T抑瘤作用减弱，PD-1抗体可rescue小鼠模型上说明还不够，检测肿瘤病人样品：肿瘤部位的FBXO38mRNA水平更低，与PD-1表达水平负相关CD3抗体激活小鼠T细胞后，FBXO38表达降低CD3和CD28抗体同时激活T细胞后，FBXO38的转录先下降后期升高除CD3、CD28抗体激活外，在加入IL-2可进一步提高FBXO38的表达其他细胞因子不具有IL-2促进FBXO38转录的作用ChIP发现IL-22能促进STAT5（IL2的下游）结合到FBXO38的Enhancer和Promoter上 – 弄清了IL-2促进FBXO38转录的机制In vivo验证IL-2的作用：IL可通过促进FBXO38的转录，抑制PD-1的表达，进而抑制肿瘤的生长      文章将分子生物学的套路搬到肿瘤免疫，从时间维度出发，观察PD-1的变化曲线，通过IP这一经典技术结合质谱大数据钓到了FBXO38，而后将其KO或KD ，看FBXO38对肿瘤免疫的作用。生命体的一切行为都有其分子基础，理清分子间的逻辑关系，再解出每种分子的晶体结构我们就可以精确的设计新的分子干预生命活动了……     Xiangbo Meng, Xiwei Liu, Xingdong Guo, Shutan Jiang, Tingting Chen, et al.FBXO38 mediates PD-1 ubiquitination and regulates anti-tumourimmunity of T cells.[J] .Nature, 2018.       想了解更多CNS级期刊前沿内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

实验室er们，吸液，测样，控温，计算参数；吸液，测样，控温，计算参数；重复的分光光度计检测分析是否严重影响了您对实验的热情？众多嗷嗷待哺的待测样本是否让您感到无从下手？当当！        今天小编就为您带来梅特勒分光光度计家族，在节省样本的前提下节省您的劳动力，减少枯燥的重复劳动。       很多分光光度计的检测都是重复分析，因此自动化设备对其极为有用。分光光度计自动化解决方案能帮助用户更高效的工作，并降低手动操作或处理带来的风险。梅特勒-托利多为您的紫外可见分光光度计任务提供了各种自动化的解决方案。自动吸液系统使用FillPalMini蠕动泵和流通池，可以从液槽自动吸取样品到比色皿进行检测，从而帮您实现在线分析目的。自动化平台InMotion组件大批量样品结合梅特勒-托利多自动化平台InMotion组件，超越系列紫外可见分光光度计可以测量高达300多个样品。酷T/自动多联池对于需要控温的测量，使用酷T进行单样品分析；或者使用多达8个比色皿位置的自动多联池进行多样品控温分析，双传感器设计使得控温精度可高达0.1度。平行动力学和多比色皿分析对于动力学测量和常规样品量，高达8位的多联池提供了高效便捷的小规模自动化解决方案，同时还可以现实多样品控温检测。多参数系统对于需要多个参数的应用，可以结合梅特勒-托利多强大的测量系统实现样品制备、分析和交叉计算功能。只需将样品放在自动进样系统中即可自动进行所有测量，所有书面工作减少到仅有一份常规报告。      集齐梅特勒分光光度计自动化五颗龙珠的您，还怕召唤不到实验成功的神龙吗？

   免疫检查点药物、CART等通过调节细胞间的互作改善免疫功能，发挥抗肿瘤作用。蛋白是细胞功能的基本单位，免疫细胞也是如此，此次整理分享的文章在免疫细胞内部做工作，cGAS-STING感知肿瘤的信号通路（肿瘤DNA激活cGAS，生成cGAMP，cGAMP激活STING，STING召集激酶TBK1，TBK1磷酸化转录因子IRF3生成IFN等细胞因子，IFN促进抗原提呈产生肿瘤特异的杀伤性T细胞），文章作者通过小分子激活STING，发挥抗肿瘤作用，具体内容如下：作者使用亲近闪烁检测法(ScintillationProximity Assay，SPA：化合物竞争性抑制靶点STING的149-379 C端与3H-cGAMP互作)进行高通量筛选，从GSK化合物库大概180万的化合物中筛选出了化合物1和cGAMP一样，化合物1在热诱导去蛋白折叠实验中可以稳定STING作者拿到了化合物1和STING C端复合物的晶体结构：STING以同源二聚体形式存在，2个化合物1分子结合到了STING上（标准配体cGAMP结合的口袋），每个分子对应结合同源二聚体的一个单体化合物1与STING的互作细节：2分子化合物1的N1-羟基苯乙基部分相互接近，不与蛋白相互作用（对药物与靶点相互作用贡献不大），所以作者用一个linker替换了这部分（linker的加入可稳定化合物在口袋内的取向，增强相互作用的同时避免了linker与蛋白不必要的互作），将两分子“化合物1”进行拼合，得到了化合物2作者又拿到了化合物2和STING复合物的晶体结构：和化合物1一样，结合到了相同的活性口袋 化合物2和STING的互作细节；相较化合物1，化合物2和STING的亲和力显著增强前面用到的是STING的一部分（C端）研究互作，化合物2可与细胞THP-1的裂解物中全长的STING结合结构层面证明化合物2可与STING结合，开始功能层面的验证，化合物2可激活cGAS-STING通路（a），促进IRF3、STING的磷酸化；加入通路抑制剂BX785后，化合物2激活通路的作用消失（b） cGAS-STING通路激活后会分泌细胞因子，化合物2可促进细胞分泌IFNβ（c），加入通路抑制BX785后细胞因子分泌受抑制（d）前面从结构、功能两个层面证明了化合物2 的有效性，但复合物晶体结构这块有点问题，文献报道cGAMP激活后的STING呈“关闭”构象（二聚体两个单体相互接近），可作者拿到的化合物2-STING复合物晶体结构呈“打开”构象，与前人工作有不一致的地方，为排除复合物结晶对构象造成的影响，作者做了氢氘交换实验（hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry） - STING在未结合配体状态（Apo）呈“打开”构象，226-236位氨基酸活泼氢交换明显；当结合cGAMP后呈“关闭”构象，226-236位氨基酸活泼氢交换很少；当化合物2与STING孵育后，226-236位氨基酸活泼氢交换亦很明显，暗示化合物2结合的STING呈“打开”构象，再结合前面的数据，暗示STING的的“关闭”构象并不是激活所必须的化合物库是葛兰素史克的，先导结构优化不会停止，作者又优化得到了化合物3In vivo实验：化合物3能显著提高野生型小鼠血清中细胞因子的含量，但对STING缺陷小鼠无此作用，暗示化合物3在体内通过STING促进细胞因子分泌 In vivo：化合物3能够抑制肿瘤生长，延长小鼠存活时间，且此作用是CD8 T细胞依赖的，暗示化合物3通过调节免疫发挥抗肿瘤作用不愧是做药的，还做了化合物3的药代动力学曲线这篇文章主体是药物化学，关注结构层面的东西，功能层面的实验用以辅助进行药物设计、验证。结构生物学为什么那么“牛”，通常都是大文章，因为生命活动是各种分子相互作用引起的，互作又是以结构为基础，弄清楚结构就能够设计干扰互作的分子，modify生命活动……        Joshi M. Ramanjulu, G. Scott Pesiridis, Jingsong Yang, Nestor Concha, etal.Design of amidobenzimidazole STING receptor agonists withsystemic activity.[J] .Nature, 2018.    想了解更多CNS级期刊前沿内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

HTRF®技术简介相时间分辨荧光技术（HTRF®）是一种用来检测纯液相体系中待测物的方法。HTRF®结合了荧光共振能量转移（FRET）和时间分辨荧光（TRF）两种技术，将FRET的均相实验方式和TRF的低背景特性融合在一起，提供了更高的灵敏度和稳定性。图1.HTRF®技术原理示意图HTRF®技术具有以下特点：a) 易于实现微型化b) 低背景，化合物和培养基的影响小c) 均相检测，操作简单，无需洗板d) 实验稳定，对酸性溶液、金属离子、EDTA等耐受；e)读数稳定24 h以上，甚至可达7天HTRF®应用说明HTRF®技术为现代药物研发提供多种服务，包括在生化水平或细胞水平上的小分子或者生物治疗药物的研发。下面举例的HTRF®应用，均采用BioTek多功能酶标仪检测。GPCR配体结合研究采用Cisbio的Tag-lite®技术研究GPCR配体与趋化因子受体CXCR4的结合实验。图2显示的是SynergyTMH1检测D2标记的CXCR4激动剂SDF1-α与Lumi4®-Tb标记的CXCR4结合以及Kd测定。还可以进行抑制剂相关研究，图3表示未标记的SDF1-α和小分子AMD3100与标记配体竞争结合实验的结果。图2. 用SynergyTMH1测定d2-SDF1-α Kd常数。测得Kd=19.6 nM（Cisbio参考值18.7 nM）图3. 竞争性实验检测。AMD3100和SDF1-α的IC50分别是29.4 nM和29 nMGPCR小分子化合物高通量筛选GPCR是以小分子化合物为基础的治疗靶点，市面上约50%的药物都直接作用于这一靶点。结合BioTek酶标仪和Tag-lite®技术，可高通量筛选小分子化合物，图4为筛选的柱状图结果。图4. 在天然产物化合物库筛选结果中，抑制效应分布比例图       BioTek酶标仪还可以用于二级筛选，通过检测出完整的化合物计量效应曲线，进而测定初筛中的化合物活效。图5是初筛中的三个阳性对照Exendin-3、Exendin-4、GLP-1的二次筛选结果。图5. 阳性抑制化合物的剂量效应曲线细胞水平的蛋白激酶实验HTRF®细胞内激酶实验可以检测信号转导通路中特异位点的磷酸化水平，原理见图6。该方法具有很好的灵敏度，可以取代传统的检测技术如WesternBlot和ELISA。图6. HTRF®细胞水平激酶检测原理：实验分为三步，信号通路激活，使得激酶底物被磷酸化；裂解细胞膜并释放被磷酸化的底物至溶液中；加入三明治免疫分析试剂后检测       检测人上皮肿瘤细胞系A431中STAT3（Tyr705）磷酸化水平，结果如图7、图8所示。图7. A．EGF对STAT3（TYyr705）磷酸化的激活效应表现为完整的剂量效应作用    B．分别从40个EGF浓度为600 nM和0 nM重复数据中计算出Z’值图8. 小分子抑制剂，SD1008，Stattic和cryptotanshinone对EGF诱导STAT3（Tyr705）磷酸化水平的抑制曲线生物治疗药物研发研发抗体药物，需要针对特定靶点（如RTK和GPCR）筛选出有效的单克隆抗体，并且一些单克隆抗体还能激活效应细胞的免疫系统，引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）过程。RTK结合实验SNAP-tag®克隆构建可以在细胞水平上间接检测cetuximab与受体酪氨酸激酶（RTK）EGFR之间的结合能力。RTK上标记Luma4®－Tb作为荧光供体，与 Cetuxima结合后，加入D2标记anti-hFc抗体，可以产生HTRF®信号（图9）。图9. 酪氨酸激酶受体EGFR上标记Lumi4®－Tb。通过D2标记的种属特异的Fc抗体可以检测抗体与目标抗原之间的结合。当目标抗体特异性结合Lumi4®-Tb标记的受体抗原，再另外加入荧光标记的二抗，并且能够结合到非标记的抗上，进而引起HTRF®信号增加       这一检测方法可以测定 cetuximab结合常数，如图10所示。图10. 采用 Cetuximab剂量效应曲线计算 cetuximab的解离平衡常数Kd细胞内CD16a结合实验在这一方法中， FcyRIIIA在细胞中稳定表达，并且γ链通过SNAP®-Tag标记Lum4®-Tb。加入荧光受体D2标记的抗人IgG抗体后，特异性产生HTRF®信号。用未标记的IgG抗体竞争取代标记的IgG抗体，相应的HTRF®的信号逐降低，因此用于评估IgG抗体与 FCYRIIIA以及γ链结合能力（如图11）。图11. 细胞水平上的竞争结合实验可以用于评估免疫治疗中IgG抗体与FCYRIIIA的结合能力并确定能否用于ADCC实验检测           图12中，证实hIgG1与FcyRIIIA有高亲和力，并且 cetuximab可以招募效应细胞和预期一样，鼠源抗体与D2标记的人源IgG抗体无竞争。图12. 测定治疗抗体与 FcyRIIIA结合能力HTRF®检测仪器HTRF®检测需要仪器支持高性能的时间分辨荧光检测模块，如果是高通量筛选的客户，还需要整体的数据管理分析系统，而BioTek可根据用户的筛选通量、检测速度及后续药理表型评估需求的不同提供多种不同的检测设备方案，例如您可以选择SynergyTMNeo2全球前沿技术的HTS设备进行高通量HTRF®筛选，或者选择灵巧的HybridTM检测系统SynergyTM H1或CytationTM系列等。（长按扫描二维码，获取更多详细介绍）如果您对HTRF®技术感兴趣，欢迎随时和我们联系，扫描微信二维码获得更多产品资料或加笔者微信：yqm0305

        CAR或双特异性抗体通过改变T细胞的靶向性发挥作用，是在细胞膜上做工作，此次整理分享的文章关注点在T细胞内部，研究蛋白BH4对T细胞功能的影响-调低它可抑制T细胞增殖，用于自身免疫病治疗；调高它可促进T细胞增殖，用于肿瘤治疗。具体内容如下：GCH1在BH4上游，从GCH1-GFP报告系统小鼠分离出T细胞，用PMA或抗体激活T细胞，发现GCH1水平（通过GFP水平反映）和T细胞激活（激活的T细胞低表达CD62L）正相关敲除GCH1不影响T细胞的发育（胸腺T细胞数受影响）和外周稳态（脾T细胞数不受影响）CD3/CD8抗体激活T细胞，16h后检测，GCH1缺陷并不影响T细胞的激活（CD62L低、CD25高的群体为激活的T细胞）和细胞因子IL-2的分泌GCH1缺陷抑制了激活T细胞增殖GCH1缺陷不影响胸腺淋巴细胞的增殖、发运GCH1缺陷不影响胸腺淋巴细胞或外周na?ve T细胞的存活又换了一个小鼠模型，再次发现敲除GCH1后，成熟T细胞的增殖受到抑制特异性敲除B细胞上GCH1后发现B细胞的发育、功能不受影响，暗示GCH1对T细胞调控的特异性GCH1敲除后Treg的发育、数目、抑制功能不受影响。至此发现GCH1对CD4T和CD8 T细胞增殖的重要性结肠炎模型，向T细胞缺陷小鼠移植GCH1正常或缺陷的T细胞，移植GCH1缺陷T细胞小鼠结肠炎症状更轻，肠道免疫细胞更少尽管GCH1缺陷是引流淋巴结CD4T细胞数目减少，但CD4T细胞产生细胞因子的能力并没有因为GCH1缺陷受到影响   结肠炎模型上发现GCH1缺陷可缓解结肠炎，在过敏性气道炎症模型上继续：GCH1缺陷组支气管肺泡中CD45、T细胞、嗜酸性粒细胞数量明显偏低，免疫反应更弱又换了一个模型看GCH1在炎症中的作用：GCH1缺陷小鼠耳肿胀明显降低，暗示GCH1缺陷有助于缓解T细胞调控的肠、气道、皮肤等炎症反应前面阐明了GCH1的作用，用药物抑制这个蛋白很难，因为这个蛋白上暂时没有找到合适的药物作用位点，作者换了一种思路，用SPRi3抑制GCH1和BH4之间的SPR从而达到抑制BH4的目的：给予SPR抑制剂SPRi3后可抑制T细胞激活后BH4的表达，达到和敲除GCH1类似的效果把敲除GCH1后做的再做一遍：SPRi3可抑制T细胞的增殖，不影响T细胞存活和激活把敲除GCH1后做的再做一遍：SPRi3可缓解结肠炎和气道过敏在人的T细胞上验证：SPRi3能抑制抗体激活后的T细胞增殖BCH1缺陷抑制T细胞的分子机制是如何呢，文章作者做了测序，通过比对BCH1正常组和缺陷组T细胞激活后的基因表达情况发现GCH1缺陷引起一些离子稳态相关基因表达上调，蛋白层面的数据也确证了（g），GCH1缺陷的T细胞激活后离子浓度显著降低GCH1缺陷后表达明显上调的蛋白mitoferrin是一个线粒体离子转运蛋白，对线粒体呼吸至关重要，所以作者对激活后T细胞的ATP生成进行了检测，发现GCH1缺陷或SPR抑制后激活的T细胞ATP生成明显减少，Lactate（乳酸盐）、Pyruvate（丙酮酸盐）水平升高，暗示糖酵解增加，BH4参与调控线粒体呼吸GCH1缺陷后，激活T细胞耗氧减少，BH4能够能够促进Cytoc-Fe3+向Cytoc-Fe2+转化Cytoc-Fe2+能够rescue SPRi3引起的耗氧减少，暗示SPR下游的BH4对呼吸的调控作用 - BH4通过影响线粒体呼吸影响T激活后的增殖    SPRi3活性及药代动力学性质都不好，所以有优化出了化合物QM385，QM385可高效的与SPR结合，抑制BH4表达QM385可有效降低血浆中BH4含量，升高Sepiapterin（SPR抑制marker）用原来的模型验证QM385的功能（支撑文档里还有，略）：抑制T细胞增殖、HDM引起的过敏反应作者试过了调低BH4，开始是调高BH4，BH4表达升高后T细胞总数不受影响，但分化水平有提高作者试过了调低BH4，开始是调高BH4，BH4表达升高后T细胞增殖加快Sep也可提高BH4的水平，促进T细胞的增殖直接给细胞“吃”BH4会促进T细胞增殖、细胞因子分泌（一直围着影响BH4表达量的通路逐个验证）又在呼吸这个维度看：Sep可rescue GCH1缺陷，促进ATP的生成调低BH4可以抑制T细胞增殖治疗炎症，调高BH4促进T细胞增殖，提高免疫可以治疗肿瘤调高BH4产生的抗肿瘤作用在T细胞缺陷的小鼠上失效，暗示BH4对T细胞的KYN可抑制T细胞增殖，BH4可解除KYN的抑制让T细胞重新增殖作者找到了一个特异调节T细胞增殖的蛋白BH4，研究它的功能，将它的“量”和疾病建立关联– 调低治疗自身免疫病，调高治疗肿瘤，没法说BH4高对我们好还是低了对我们好，适量就好，干嘛非要一维、单向的看待事物……Shane J. F. Cronin, Corey Seehus, Adelheid Weidinger, Sebastien Talbotet al. The metabolite BH4 controls T cell proliferation in autoimmunity andcancer.[J] .Nature, 2018.想了解更多CNS级期刊内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

各位实验室工作者们大家好~应用指南的小编又和大家见面啦。双十一已经过去一周了，不知道各位的快递是否还在路上呢？；）虽然不能帮大家催下马爸爸，但是这周小编为大家带来了内参的知识，包括为什么，是什么，怎么做三部曲，具体内容大家请下滑：Western Blot为什么必须要用内参？检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot，因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。但是，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别是当表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。在国外发表的文章中，WesternBlotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。因此在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。What is 内参？内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(HousekeepingProteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。小编列了一些常用的内参蛋白及使用注意事项，可供大家参考。内参蛋白样品类型分子量（kDa）注意事项GAPDH全细胞/胞质内参30-40   不适合核提取物β-actin全细胞/胞质内参43不适合与氧相关的研究α-tubulin全细胞/胞质内参55不适合涉及年龄差异较大的受试者的研究Lamin B1核内参68不适合胚胎干细胞COX IV线粒体内参16不适合15-17 kDa蛋白Transferrin血清内参79转铁蛋白水平可能受某些疾病状态和治疗影响Histone H3核内参15不适合15-17 kDa蛋白如何利用内参进行定量分析实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果(如下图)。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。经过小编本次科普大家是否对内参的了解更加深入了呢？更多关于内参的调节请见下次分享。GE Amersham Imager 680想要了解更多产品应用指南最新内容以及CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可通过手机与笔者交流：13810577182！

深度重点：上海仪迈的旋光仪，折光仪，分光光度计！德泉是北京，山西地区的独 家经销商；山东，内蒙，天津，河北地区的特约经销商。（国产良心厂家）我叫王大锤，我的梦想是：完成所有产品销售数字！拿到年终奖金！当上总经理！成为高富帅！迎娶白富美！走向人生巅峰！哇哈哈哈哈哈哈！！！！！！！！想想还有点小激动呢。哎，怎么有人打我？（原来是老板怕我上班睡觉的时候着凉，一巴掌把我扇醒了，嗯，老板真是关心我，好感动）王大锤你丫上班的时候竟然睡觉，还想不想干了！产品推文发了吗？数字完成了吗？作为一名合格的产品销售，这些东西还能难倒我吗？推文早发了！老板请看：      仪迈旋光仪，折光仪的实际应用不要再问我仪器在哪些地方可以应用，请往下看！仪迈会给你选择的正确理由！FD软件，视情况选配使用选择理由：1、独具FD模式，满足QC管理需求，用户实现GMP要求！符合多种测量规范及药典，满足GLP（药物质量规范）！如果你是做食品和制药行业的企业等用户FD模式是你最优选择！  如果你们是做出口药物或者食物的仪迈FD是你所需要的！ 2、欧洲技术，中国品牌！拒绝死机，振荡，漂移。性价比超高！       去掉FD模式，高校教学和研究测定，仪迈都以优质技术保证使用效果！（FD模式会稍微贵一些，    对于高校教学和测定显得多余！良心推荐）仪迈是国产品牌，对，你没有听错。国产最良心的厂家，不贴牌售假，坚持厂家自己派工程师做3Q培训。目的是想多听听用户的声音。因为他们想把仪迈真正意义上做成中国人自己的品牌！喂！实际应用！谁不知道仪迈是良心厂家，还用你说吗？是不是不想干了？再给你一次机会！好的，老板！我们来看一个实验！味精纯度的表征—旋光度换算谷氨酸钠含量！ 味精中的主要成分为谷氨酸钠，谷氨酸钠分子结构中含有一个不对称碳原子，具有光学活性，能使偏振光面旋转一定角度，因此可用旋光仪测定旋光度，根据旋光度换算谷氨酸钠的含量。谷氨酸钠的含量是检测味精纯度的一个重要指标。样品名称：含谷氨酸钠 99%以上的味精；测试仪器：IP-digi300/2 数字旋光仪；测试环境：室温：22℃；测试方法：称取试样10g，加少量水溶解并转移至100ml 容量瓶中，加盐酸20ml,混匀并冷却至20℃附近，定容并摇匀；样品测试指标：项目指标谷氨酸钠（%）≥99.0比旋光度+24.9~+25.3IP-digi300/2 数字旋光仪自带帕尔贴温控系统，可直接设置温控至20℃测量，无需再进行温度补偿计算；仪器设定：测量方法：比旋度；温度控制：20℃，并开启温控；旋光管长度L=1；   浓度C=10g/100ml；将样品装入 1dm 恒温旋光管，直接测比旋度，测量6 次；测试结果：测量温度 测量数值（比旋度）换算后谷氨酸钠含量20℃ 25.103 99.77%20℃ 25.107 99.79%20℃ 25.100 99.76%20℃ 25.104 99.78%20℃ 25.104 99.78%20℃ 25.105 99.78%样品中谷氨酸钠含量按以下公式计算，其数值以%表示。结论：测试结果显示样品味精中谷氨酸钠的含量在99%以上，符合味精的理化要求。IP-digi300/2数字旋光仪完成对同一样品味精中谷氨酸钠的测量6 次，相对平均偏差不超过0.3%，结果准确、稳定、有效。 嗯，这个案例还不错！推文马马虎虎算你过了！ 王大锤，马上年底了，产品销售数字完成的怎么样了？ 嗯......老板咱们还是聊聊应用吧！ 我叫王大锤，万万那没想到，最后我还是实现了自己的梦想，因为老板又给了我一次机会，让我当上了这个产品的总经理！哈哈哈哈哈！ 今年开始要为仪迈旋光和折光大力铺一下北区市场！国产良心厂家，应该被发现啊！这是机遇啊！实现梦想的机遇啊！我是王大锤，明年我就要成为高富帅了，并且走向人生巅峰！想想都有点小激动呢！上海仪迈的旋光仪，折光仪，分光光度计！德泉是北京，山西地区的独 家经销商；山东，内蒙，天津，河北地区的特约经销商。（国产良心厂家）最后告诉你一个秘密：做仪迈的品牌，别看是国产，也是很有利润空间的哦！经销商伙伴们要抓住机遇哦！欢迎拨打010-83834948、63836985或关注我们的二维码以了解更多产品信息。

   双特异性抗体一端识别TCR，另一端识别肿瘤特异性抗原，通过连接T细胞和肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。抗体制备已不是什么难题，难的是寻找肿瘤特异性的抗原，HER2是一类乳腺癌抗原，但正常上皮细胞也会表达HER2，因此靶向HER2的双特异性抗体会引起on targrt，off tumor毒性。此次整理分享的文章作者发现了更加肿瘤特异性的抗原-p95HER2，设计、制备了针对p95HER的双特异性抗体，具体内容如下：HER2阳性的肿瘤细胞中会有p95HER2亚群，上图为两种分子细胞表达模式图分析HER2、p95HER2在正常组织的表达情况：IHC和WB两种技术都确认p95HER2在正常组织中没有表达双特异性抗体设计：抗体分子上有两个识别p95HER2的结构域，1个识别TCR上CD3?的结构域- 2:1模式，这种模式的优势在于单个药物分子更易识别肿瘤细胞，避免在没有识别肿瘤细胞时就识别结合T细胞，引起不必要的T细胞激活；Fc段被突变避免结合到Fc受体上流式检验双特异性抗体对T细胞、肿瘤细胞的识别：选择性结合到PBMC和表达p95HER2的肿瘤细胞所设计的双特异抗体会结合到过表达HER2的细胞上（D），作者猜想p95HER2是由编码HER2的mRNA合成的，过表达HER2时在HER2合成过程中也合成了p95HER2，所以发生了D图的问题。为验证猜想，作者更换了载体，用M611A载体过表达HER2，发现双特异性抗体p95HER2-TCB不会再结合过表达HER2的细胞上，再次说明p95HRE2-TCB的特异性In vitro：p95HER2-TCB可介导T细胞特异性的对表达p95HER2的肿瘤细胞产生反应（激活marker CD25、细胞毒性、细胞因子）In vivo：小鼠先种表达p95HER2的肿瘤，然后移植PBMC，之后给药。p95HER2-TCB可显著抑制肿瘤生长（B），减少肿瘤细胞（D，IHC检测得到的数据），促进T细胞对肿瘤组织的浸润（E）目前针对HER2的单抗药物赫赛汀（曲妥单抗）对脑转移的肿瘤无效，作者又测试了双特异性抗体对脑部肿瘤的效果：p95HER2-TCB可抑制脑部肿瘤细胞生长，暗示其具备赫赛汀所不具备的穿过血脑屏障的能力有效性验证完验证安全性，p95HER2-TCB不会像HER2-TCB一样结合到表达HER2的肿瘤细胞（MCF10A）或正常的上皮细胞（NEC），不会引起T细胞的激活，引起细胞毒作用 接着验证安全性，p95HER2-TCB不会结合心肌细胞，引起T细胞激活，从而对心肌细胞产生毒性作者想摸索一个双特异性抗体有效引起免疫反应所需肿瘤抗原p95HER2表达水平，这个实验需要在小鼠身上进行，首先对用到的实验素材-病人源肿瘤细胞进行验证：比对原始肿瘤和离体培养一段时间之后的肿瘤p95HER2表达水平的变化，通过H score分析，发现离体培养肿瘤抗原p95HER2的表达水平很大程度上未发生改变，暗示病人源肿瘤素材（PDX）可用文章作者构建了一个TCR报告系统，当双特异性抗体通过识别肿瘤抗原和TCR将肿瘤细胞（PDX）和表达了TCR荧光报告系统的Jurkat-Luc细胞连接到一起，可检测到光信号，绘制p95HER2-TCB浓度-光信号曲线和p95HER2表达量-光信号曲线，从而计算得到双特异性抗体起效所需要的肿瘤抗原表达水平找了两个p95HER2表达水平的病人源肿瘤验证，p95HER2-TCB可有效抑制p95HER2表达水平高的肿瘤细胞生长，对p95HER2抗原表达低的肿瘤抑制生长作用不明显，说明评估抗原表达水平对预测双特异性抗体疗效具有指导意义文章厉害的点在于找到了新的、特异性更强的肿瘤抗原，并且以2:1的模式巧妙设计双特异性抗体。相较小分子，抗体药物在特异性上有着无可比拟的优势 - 它与靶点的互作界面更大，通过精心调整互作界面氨基酸序列更能实现“指哪打哪”的目的。       Rius Ruiz Irene,Vicario Rocio,Morancho Beatriz et al. p95HER2-T cellbispecific antibody for breast cancer treatment.[J] .Sci Transl Med, 2018.   想了解更多CNS级期刊更多内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

上周我们介绍了Amersham Typhoon™在染色质复制相关研究中的应用，本周我们来看一下Amersham Typhoon在转录后调控中的应用。mRNA和长非编码RNA（LncRNA）的甲基化在病毒、细菌、动植物中普遍存在，并影响mRNA的加工、翻译及稳定性，参与细胞发育、分化以及热激转录等多个重要的生理过程。RNA甲基转移酶和去甲基化酶可以在mRNA和LncRNA上引入或去除N6-甲基腺苷（m6A），调控其甲基化状态。RNA甲基转移酶能够有效催化甲基转移，研究表明RNA甲基转移酶由METTL3和METTL14构成，但各亚基具体功能尚未明确。发表在Nature上的文章“Structural basis of N6-adenosine methylation by the METTL3–METTL14 complex”里，通过METTL3-METTL14异二聚体与配体（S-腺苷甲硫氨酸）共结晶，发现METTL3和METTL14均采用I级MTase折叠，并通过广泛的氢键相互作用，产生带正电荷的凹槽，推测该富含正电凹槽为RNA结合区。同时S-腺苷甲硫氨酸只与METTL3结合，而与METTL14不结合。将预测的RNA结合区内正电氨基酸突变为不带电或带负电氨基酸，用32P标记RNA，进行EMSA实验，验证RNA与蛋白复合体的结合，实验结果用Typhoon进行成像分析。发现当该区域氨基酸突变后，RNA与METTL3和METTL14复合体的结合减少，表明该富含正电沟槽为RNA结合区。结合其他实验证明，在m6A MTase复合物中，METTL3结合S-腺苷甲硫氨酸，催化甲基转移，而METTL14提供结合RNA的支架平台。本周的分享就到这里了，希望对大家有所帮助。 

伴随着激光共聚焦扫描成像仪Amersham Typhoon™ 进入市场数十年，其在各方面的应用也在不断发展。我们搜集了用户在使用Amersham Typhoon™进行的各方面研究成果，分享给大家。今天，我们先来介绍Amersham Typhoon™在染色质DNA水平的调控中的应用之染色质复制。在真核生物中，目前有关DNA复制的相关机制研究比较深入，然而对染色质的复制和表观遗传信息传递的分子机理尚待深入的研究。DNA的复制往往伴随着染色质结构的组装，因而子链上核小体的组装和DNA合成是紧密耦联，这一过程可以称之为DNA复制耦联的核小体组装（DNA replication–coupled nucleosome assembly），对维持基因组的完整性具有重要作用。尽管此前许多研究发现了一些组蛋白分子伴侣参与核小体组装，但是这一过程是如何耦联到DNA复制上的这一具体分子机制仍然不清楚。2017年在Science上发表的” RPA binds histone H3-H4 and functions in DNA replication–coupled nucleosome assembly”一文，报道了一个能够结合单链DNA的重要复制蛋白A（RPA,replication protein A）复合体在DNA复制耦联的核小体组装中的重要作用，对阐释DNA复制耦联的核小体组装具有重要意义。该研究首先通过co-IP分析得出RPA蛋白与组蛋白H3-H4在S期能形成RPA-H3-H4复合物。为了研究该复合物对形成DNA-组蛋白复合物的影响，该研究设计了模拟新解旋复制叉的ss-dsDNA和对照dsDNA，使用EMSA实验进行分析。结果表明：H3-H4与ss-dsDNA和dsDNA（H3-H4形成了二聚体和四聚体，dsDNA-(H3-H4)复合物出现两条带）均能结合（蓝色箭头）。发现PRA与ss-dsDNA能够形成RPA-DNA复合物（绿色箭头），而与dsDNA结合能力很弱，表明RPA结合在ss-dsDNA中的单链部分。随着RPA浓度的增加，形成的RPA-DNA-(H3-H4)复合物增多（红色箭头），表明RPA促进DNA与H3-H4的结合；而在dsDNA中，则无此作用。进一步，为了确定H3-H4组装到ssDNA还是dsDNA上，结合EMSA加入了HhaI酶切。结果表明，当H3-H4结合后，对ss-dsDNA形成了保护作用，使其不能被切断（蓝色箭头），从而确认H3-H4组装位置在双链DNA上。结合其他实验，该研究发现：RPA能够直接结合没有修饰的H3-H4组蛋白复合体，促进ssDNA-(H3-H4)复合体的形成，并能迅速的将H3-H4连接到相邻的dsDNA上，同时招募一系列组蛋白分子伴侣（CAF-1、FACT和Rtt106）协助新的核小体的组装。这一研究表明，RPA在新生染色质上的核小体组装中起到重要作用，其通过协调多个组蛋白伴侣，将组蛋白掺入到复制叉上，为DNA复制偶联的核小体组装提供了一个很好的“平台”。

细胞表面表达着各种受体，这些受体用于感知环境变化以使细胞做出相应调整，其中免疫调节受体发挥着至关重要的作用，此次整理分享的文章讲的就是肿瘤表面一种免疫抑制性分子-LILRB4，文章作者深入研究了LILRB4的作用机制，具体内容如下：  从零开始比较难，作者在TCGA数据库中检索、分析免疫调节分子和病人存活率的关系，发现LILRB4的mRNA水平和存活时间负相关  对105个病人样本进行检测，发现LILRB4主要表达于单核细胞和单核急性髓性白血病细胞，且单核急性髓性白血病细胞表达水平更高（AML subtypes by the French-American-British (FAB) classification, acute myeloblastic leukaemia with minimal maturation (M1, n = 9), acute myeloblastic leukaemia with maturation (M2, n = 34), acute promyelocytic leukaemia (M3, n = 10), acute myelomonocytic leukaemia (M4, n = 34), acute monocytic leukaemia (M5, n = 25), acute erythroid leukaemia (M6, n = 2), and acute megakaryoblastic leukaemia (M7, n = 1)），有特异性表达的意思，暗示有作为治疗靶标的价值  将LILRB4阳性（B4+）或阴性（B4-）的肿瘤细胞与病人T细胞或健康人T细胞共培养，发现LILRB4阳性细胞可抑制T细胞增殖 共培养实验暗示LILRB4表达的肿瘤细胞可抑制T细胞生长，作者做了LILRB4不同的细胞系：LTLRB4 KO组 - 敲掉LILRB4的肿瘤细胞（T）无法再抑制T细胞增殖（E）；LILRB4 KO-WT组 - LILRB4缺陷的肿瘤细胞重新表达LILRB4后又可抑制T细胞增殖；LILRB4 KO-int△组 – 表达LILRB4胞内段缺陷蛋白的肿瘤细胞无法抑制T细胞增殖  继续共培养实验：LILRB4表达肿瘤细胞可影响T细胞周期  共培养实验：敲除LILRB4后的肿瘤细胞无法再抑制T细胞增殖 做完敲除做阻断，LILRB4抗体可解除LILRB4肿瘤细胞对T细胞的抑制作用  LILRB4抗体可增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用（q用PI染色看杀伤；r、t中肿瘤细胞表达GFP，通过GFP阳性群体占比看杀伤；s看T细胞数目；u看T细胞生成细胞因子的能力）  上面通过肿瘤细胞和T细胞共培养，in vitro的看LILRB4对肿瘤细胞抑制T细胞的贡献，开始in vivo实验：敲除LILRB4的肿瘤细胞成瘤能力弱，抑制T细胞的作用弱  LILRB4抗体可抑制成瘤，解除LILRB4对T细胞的抑制  LILRB4抗体抑制肿瘤延长存活时间的作用不依赖于Fc段（anti-LILRB4-N297A为fc段突变无功能型抗体），依赖与CD8 T细胞（anti CD8敲除T细胞后LILRB4抗体无法再抑制肿瘤生长延长存活时间）  将病人肿瘤直接抑制到小鼠上，发现LILRB4抗体可抑制肿瘤的发展。到这里，作者发现LILRB4信号可抑制T细胞发挥促瘤作用  Dox诱导敲除LILRB4后，肿瘤细胞（表达了GFP）对肝脏、骨髓的浸润降低  LILRB4抗体亦可降低肿瘤细胞对骨髓、肝、脑的浸润  敲除CD8后，LILRB4抗体抑制浸润的作用仍在，暗示抗体阻断浸润的作用不依赖于T细胞，LILRB4参与调节肿瘤细胞的浸润  LILRB4敲除后肿瘤细胞的迁移、归巢能力降低，小鼠存活时间延长、体重减重延缓  敲了看还不过瘾，让一个不表达LILRB4的细胞表达LILRB4后看对迁移、归巢、生存时间、体重的影响，再次暗示LILRB4参与调节肿瘤细胞的浸润，存在促瘤作用，小鼠健康状态负相关  LILRB4促进浸润的作用依赖LILRB4的胞内段  LILRB4抗体可特异性的阻断单核AML细胞（CD45+、CD33+、LILRB4）的浸润。至此，继证明LILRB4可抑制T细胞功能，又证明LILRB4还参与调节肿瘤细胞的浸润  前面证明了LILRB4的功能（抑制T细胞、促进肿瘤细胞浸润），它表达于肿瘤细胞表面，发挥作用依赖胞内信号段，必然存在与其结合的配体，作者设计了一个基于GFP的报告系统以筛选LILRB4的配体：基于已有文献，尝试了一系列配体均无法激活LILRB4，发现小鼠和人的血清可特异性的激活LILRB4  用蛋白纯化分离，之后用GFP报告系统筛选血清中能激活LILRB4的组分，发现APOE可特异性的激活LILRB4  反过来再验证：APOE敲除小鼠的血清无法激活LILRB4  继续验证APOE可与LILRB4结合：APOE与敲除LILRB4细胞的结合能力弱  MST、SPR、Octet技术多方法确证APOE可与LILRB4结合  突变法找APOE上与LILRB4结合的关键位点（还是用GFP报告系统验证）：W106和Y121  结构角度证明了APOE可结合LILRB4，开始功能角度的验证：敲除APOE可达到和敲除LILRB4相似的效果 – 解除共培养时肿瘤细胞对T细胞的抑制作用  不同的肿瘤细胞（GFP或GFP LILRB4）与T细胞共培养，加入不同的血清（野生型小鼠血清-WT或APOE缺陷型小鼠血清-APOE KO），比较T细胞的比例：加入APOE缺陷小鼠血清组T细胞比例更高，缺陷血清中添加APOE-POPC又可降低T细胞比例，暗示APOE对T细胞抑制作用存在贡献  不同的肿瘤细胞移植到不同的小鼠上，APOE缺陷的受体鼠肿瘤细胞骨髓、肝、脾浸润更低，暗示APOE对肿瘤浸润存在贡献  前面顺藤摸瓜摸到了LILRB4的配体，开始看LILRB4被激活后肿瘤细胞内部的信号变化：参考前人研究，将目光放到了SHP磷酸化上，KO LILRB4后，SHP-2的磷酸化降低，暗示LILRB4通过SHP-2起效  KO 肿瘤细胞SHP-2可解除肿瘤细胞对T细胞的抑制，减少浸润，暗示LILRB4通过SHP-2发挥作用  RNA测序比较野生型和LILRB4缺陷型细胞，由找到了另一个位于LILRB4下游的信号，使用该信号抑制剂BAY11可解除对T细胞的抑制、减少浸润  LILRB4、APOE、SHP-2都是肿瘤细胞上的，LILRB4肿瘤细胞可抑制T细胞，但这个作用必须通过特定物质传递到T细胞，野生型肿瘤细胞产生的条件培养基可抑制T细胞的增殖，看LILRB4缺陷型的肿瘤细胞的条件培养基无明显抑制作用  找肿瘤细胞条件培养基中发挥T细胞抑制作用的的组分，比对发现两种条件培养基中又一系列蛋白含量存在差异  敲掉肿瘤细胞LILRB4后，uPAR在肿瘤细胞表面的表达降低  LILRB4缺陷肿瘤细胞和T细胞共培养体系中加入uPAR可抑制T细胞的生长，暗示uPAR在LILRB4抑制信号下游，即便没有LILRB4扔可抑制T细胞增殖  向T细胞培养体系中添加uPAR并不会抑制T细胞增殖，说明uPAR需作用在肿瘤细胞之后才可发挥抑制作用  LILRB4敲除后，uPAR表达会下调，同时ARG-1也会下调，且活性降低  ARG-1可不依赖APOE、LILRB4、SHP-2发挥抑制T细胞增殖、促进肿瘤细胞浸润的作用 – 终于找到了LILRB4信号的“效应分子”  做了这么多工作就是这么一张图：肿瘤细胞上APOE激活LILRB4后SHP-2磷酸化，NFkB信号激活，uPAR表达升高，ARG-1升高，最终抑制T细胞、促进肿瘤细胞浸润  流式是个很好的技术 – 把LILRB4信号关键节点一次都给测了！ 文章始于数据库检索分析，根源是对大数据的把握！找到信息点后按照分子生物学的思路顺藤摸瓜，滤清了一条免疫抑制信号 – 生命体的一切行为都有其分子基础，这就是规律，就是套路…… Mi Deng, Xun Gui, Jaehyup Kim, Li Xie, Weina Chen et al. LILRB4 signalling in leukaemia cells mediates T cell suppression and tumour infiltration.[J] .Nature, 2018. 想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

IgA是肠粘膜中重要的免疫组分，可与肠道上皮细胞pIgR受体和肠道微生物结合，避免肠道微生物侵袭肠组织，保证肠道微生物和人体维持相安无事的共生关系。DC细胞处在与肠道微生物博弈的第一线，肠固有层内DC细胞通过TLR受体感知微生物抗原，调节肠道免疫，此次整理分享的文章研究的就是肠道DC细胞发挥作用的信号通路层面的机理。 文章作者相研究肠道免疫，关注DC细胞，通过检索文献，将目光投到了DC细胞上的NIK（NF-κ B-inducing kinase），条件敲除DC细胞上的NIK（Map3k14为编码NIK的基因）  敲除DC细胞上的NIK之后不影响DC细胞在各部位的比例  NIK敲除后不影响DC细胞的成熟及各种表面marker的表达 NIK不影响各种DC细胞亚型，综合起来看NIK不是DC发育、成熟所必须的  DC自身表型没啥明显变化，平板培养法和16sRNA测序法同时看它所处的环境肠道微生物，发现有的菌群含量发生了变化  对肠道菌进行详细研究，发现大多数菌都是IgA阳性的（IgA可结合细菌）  敲除DC细胞NIK影响肠道菌群，同时大部分菌又是IgA阳性的，所以作者去看了IgA的量，发现敲除NIK后排泄物中IgA含量降低  有意思的是尽管敲除NIK后排泄物中IgA含量降低，但负责生产IgA的B细胞比例、产量并没发生变化，血清中IgA含量也没有发生变化  敲除DC细胞上NIK后，肠上皮细胞（IEC）的pIgR表达下调  将野生型小鼠和DC细胞NIK敲除小鼠混养后，肠道微生物含量不在有差异，但NIK缺陷引起的排泄物IgA、pIgR下调依然存在，暗示NIK缺陷对IgA和pIgR的影响不是通过肠道微生物传递的 – 还得继续挖机制  文献提示DC细胞可调节肠粘膜T细胞亚群，检测发现敲除DC细胞的NIK后只有肠固有层Th17细胞比例下降，其他组织Th17细胞比例不受影响，暗示Th17参与NIK缺陷引起的变化  上面的数据暗示Th17参与了NIK缺陷引起的pIgR和IgA含量的变化，Th17可分泌IL-17，用抗体α-IL-17中和掉IL-17后发现野生型和NIK缺陷型的pIgR和IgA不再有差异，暗示NIK通过Th17分泌的IL17发挥作用  果然，IL-17可rescue NIK缺陷引起的变化，更加说明NIK通过Th17分泌的IL-17发挥作用  NIK缺陷还引起ILC（innate lymphoid cells）比例降低，暗示NIK还可调节ILC  前面看的都是敲除DC上NIK之后DC外部的变化（肠道微生物、IgA、pIgR、Th17），开始看敲除之后DC自身的变化：发现只有肠固有层（LP）DC细胞表达的IL23a下调（IL12a在IL23a的下游，所以跟着下调了），而系膜下淋巴结（MLN）DC细胞细胞因子表达没有发生变化，暗示NIK对肠道DC功能调节的专属性  DC可通过TLR感知刺激，各种微生物抗原可与TLR互作促进DC表达分泌细胞因子，NIK敲除后DC感受TLR配体刺激表达IL23a和IL12a的水平降低了  蛋白水平看，NIK敲除后DC感受TLR配体刺激分泌的IL23a减少了  通过分析NIK敲除后DC自身的变化找到了IL23和IL12，用抗体（α-p40）中和两种细胞因子后，野生型小鼠的Th17、ILC比例也出现了和NIK缺陷相同降低趋势，暗示DC上的NIK是通过IL23发挥自己的作用的  用抗体（α-p40）中和两种细胞因子后，NIK缺陷引起的IgA和pIgR的变化在野生型上也重现了出来，再次说明NIK通过IL23发挥作用   一直在“往根儿上”挖，前面发现NIK缺陷后DC上TLR响应配体刺激分泌某些细胞因子的能力减弱，这个是受信号通路控制的，所以开始往通路上“挖”，NIK在NF-κ B通路中发挥重要作用，所以看NIK缺陷后对这个通路信号的影响：NIK缺陷不影响经典的NF-κ B成员激活（RelA，c-Rel，p50，IκBα），影响非经典的NF-κ B信号成员p52的生成，至此挖到了NIK发挥作用的信号通路  至此，找到了NIK通过IL23发挥作用，依赖非经典的NF-κ B信号，那两者有和关联呢，进行ChIP实验，用IL23a的启动子去“钓”蛋白，发现NIK缺陷后p52、RelB于IL23a的启动子互作减弱，综合起来看，TLR配体刺激通过NIK依赖的方式激活非经典NF-κ B信号，促进IL23的表达引起下游Th17、IgA、pIgR等的变化  接着挖，往NIK上游挖：生理条件下，NIK降解是由cIAP、TRAF2、TRAF3组成的泛素连接酶复合物引起的，TLR配体刺激后TRAF2发生降解（泛素连接酶复合物会因此而减少，进而NIK降解减少），TRAF2在TNFR通路中发挥作用 - 又挖出了交叉信号，在TNFR通路中，TRAF2的降解依赖TNFRII  TLR配体刺激户降解TRAF2的TNFRII表达水平升高  抗体中和TNFRII后，CpG引起的TRAF2降解受抑制，IL23表达受到抑制  用抗体阻断TNFRII看完还不“过瘾”，在TNFRII缺陷的细胞上又看：TNFRII缺陷后，TLR配体刺激引起的TRAF2降解作用、IL23生成受到抑制，暗示NIK起效依赖TNFRII  TNFRII缺陷引起和NIK缺陷相似的变化（IgA、pIgR、Th17、ILC），再次暗示TNFRII在NIK发挥作用过程中扮演角色  前面采取敲除的方法发现NIK缺陷后引起的细胞、分子层面的变化及引起这些变化的机理，NIK缺陷使DC分泌的IL23减少，肠道Th17、IgA、pIgR下降，说明NIK对这些免疫成分起正向促进作用，开始宏观看NIK这一分子在病理条件下的作用：NIK敲除后，小鼠在微生物感染后体重下降迅速、结肠缩短（暗示结肠炎）、个部位微生物含量升高，说明NIK起维持免疫稳态的作用  NIK敲除后小鼠抵御微生物感染的能力减弱，结肠受损  NIK缺陷后，微生物感染小鼠Th17细胞比例显著下降  NIK缺陷后，微生物感染小鼠细胞因子生成及细胞因子下游信号受限，综合起来看说明了NIK在病理条件下发挥重要作用  上面是用微生物感染模型说明NIK在病理条件下的作用，换另一肠道病理模型 - IL10缺陷小鼠模型（会自发肠炎）看NIK的作用：NIK可引起一系列细胞、分子水平的变化以发挥维持肠道稳态的作用 肠道是人体很有意思的一个地方，因为这个地方有很多“非己”成分-肠道共生菌！某种意义上讲认为肠道共生菌是一门心思对我们好是很傻很天真的，实质是微生物和免疫细胞在博弈，肠道部位必须“驻兵”，否则我们就会生病，因为没有免疫细胞或免疫细胞打盹了的话，肠道共生菌一定会“开战”̷̷两个群体以细胞为基本单位，互扔“分子”进行试探：你“丢”过来一个LPS，我的TLR接住，然后分泌IL23，IL23去刺激Th17，Th17再分泌IL17，IL17再引起IgA生成，而后“丢”回给你 – 科研做的是啥，就是揣摩对手的“心理活动”、调节自己的“心理活动”̷̷         Jie Zuliang,Yang Jin-Young,Gu Meidi et al. NIK signaling axis regulates dendritic cell function in intestinal immunity and homeostasis.[J] .Nat. Immunol., 2018.         想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

苹果脆不脆？口红涂抹力度是否合适？品尝？试用？ 如何表征这些数据。 将感官数据化的神器通过机械设备的量化分析代替人们对食用品的感觉    博勒飞ct3质构仪为何要质构分析（应用）：1、减少样品的不合格率2、消费者通过质构分析参数判断选择食用品3、研发新产品，指导研究方向4、对物性进行测试和评估，保持生产惯性 食品领域应用神器：扯断面团面筋力和距离生面团粘性火腿肠新鲜度、韧性咬断样品需要的力新鲜果蔬硬度和脆度黄油的粘稠性护理品，药品，包装行业，各种材料领域同样可以使用：口红的硬度包衣和药品的粘附性 挤出牙膏的力材料的粘附强度产品可感觉的所有的机械的、几何的和表面的特性，包括用合适的、视觉和声觉的有关机械、感官的感觉。想要了解更多博勒飞最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：x18712855329，德泉理化产品部经理谢晓皖电话：15652392220！

         新英格兰医学杂志最近报道（Tawbi Hussein A,Forsyth Peter A,Algazi Alain et al. Combined Nivolumab and Ipilimumab in Melanoma Metastatic to the Brain.[J] .N. Engl. J. Med., 2018, 379(8): 722-730）PD-1单抗Opdivo(nivolumab)联合CTLA-4 Yervoy(ipilimumab)治疗黑色素瘤脑转移疗效显著，想起之前读过但没有整理上线的关于另外一个免疫检查点TIGIT的文章，分享一下： 别人研究T细胞上的免疫检测点，而且多为PD-1和CTLA-4，文章作者另辟蹊径研究免疫检查点TIGIT，NK和T细胞都表达TIGIT，作者找到了切入点：浸润到肿瘤边缘（PT）的NK细胞TIGIT水平低于肿瘤中心位置（IT），但浸润到边缘、中心的T细胞TIGIT表达无差异  多种肿瘤模型中NK细胞都表达TIGIT，且随肿瘤进展表达水平升高，浸润到肿瘤的NK较脾中NK TIGIT表达水平高 在多种肿瘤模型中，PD-1、CTLA-4、TIGIT三种免疫检测点，NK细胞主要表达TIGIT  比较TIGIT阴性、阳性NK细胞细胞因子分泌能力、功能性marker表达，发现表达TIGIT的NK细胞处在疲劳状态  TIGIT配体CD155各种肿瘤细胞上高表达，暗示在肿瘤微环境中NK功能受限  正看了TIGIT表达对NK细胞表型的影响之后反向看-敲掉TIGIT：TIGIT敲除后肿瘤肺转移减少，小水存活时间延长  TIGIT敲除后T细胞功能和NK细胞功能增强  特异性只敲除NK细胞上TIGIT（红色组），不但NK功能增强（激活marker CD226表达升高，抑制marker CD96表达降低），而且T细胞疲劳降低  特异性只敲除NK细胞上TIGIT亦能延长荷瘤小鼠存活时间，且作用和TIGIT完全敲除相当  前面是用敲除这种“暴力”的手段反向验证，换个“文明”点的手段 – 单抗阻断：CT26结肠癌模型中，TIGIT单抗阻断检查点后抑制肿瘤生长，延长小鼠存活时间，肿瘤浸润NK细胞功能增强  TIGIT单抗还提高肿瘤浸润CD8 T细胞的功能  静脉注射乳腺癌模型中，TIGIT单抗抑制肿瘤细胞肺生长、转移  MCA诱导的纤维素瘤模型中，TIGIT能够抑制肿瘤生长、延长小鼠存活时间  多种方法（皮下接种、静脉接种、高肿瘤负担）的黑色素瘤模型中，TIGIT单抗能够延长小鼠存活时间、抑制肿瘤生长  T细胞、NK细胞都表达TIGIT，很难说TIGIT阻断后对肿瘤免疫的功劳是谁的，所以继续“敲”，先敲了获得性免疫，在三种T、B细胞不同程度缺陷的小鼠上，NK细胞的TIGIT表达水平升高  三种固有免疫缺陷小鼠身上TIGIT阳性的NK细胞依然处在抑制状态  在固有免疫缺陷的小鼠身上，阻断TIGIT后NK功能增强，依然能够抑制肿瘤细胞生长  开始“敲”NK，NK敲除后转移增加，T细胞功能受限，暗示NK细胞可抑制转移、参与调节T细胞功能  敲掉NK之后TIGIT单抗延长荷瘤小鼠存活时间的作用消失，暗示TIGIT单抗起效NK细胞是必要的  开始“组合敲”：单敲CD4 T，TIGIT单抗依然有效，CD4、CD8都敲了TIGIT单抗作用消失，说明TIGIT单抗起效除了依赖NK外不依赖CD4 T细胞，依赖CD8 T细胞  敲IFN-γ，TIGIT单抗作用减弱，暗示单抗起效还部分依赖IFN-γ  除TIGIT单抗依赖NK细胞外，PD-L1单抗起效（抑制肿瘤生长、延长存活时间、增强CD8 T细胞功能）也依赖NK细胞，暗示阻断NK细胞TIGIT，解除NK细胞疲劳的重要意义  用过TIGIT单抗的小鼠可在肿瘤re-challenge模型中继续长时间存活，暗示TIGIT单抗使用后产生了免疫记忆 笔者妄测：基础研究发现了多个免疫检查点PD-1、CTLA-4、TIGIT，好做、效果强的让人先做了，文章作者视角独特，把眼光放到细胞免疫的另一个重要角色NK细胞，由肿瘤边缘、中心的差异为起点，将关注度相对不那么高的免疫检查点TIGIT和NK细胞、肿瘤免疫建立了相关性，同种细胞空间异质性造成了TIGIT表达的差异，是不是还会有其他差异…… Zhang Qing,Bi Jiacheng,Zheng Xiaodong et al. Blockade of the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cell exhaustion and elicits potent anti-tumor immunity.[J] .Nat. Immunol., 2018. 想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

减少“on target，off tumor”是CART改造的一种策略，另一种策略是提高CART抵抗实体瘤免疫抑制微环境的能力。针对“微环境”改善策略，之前整理分享过关于逆转TGF-β免疫抑制作用的CART相关文章，此次整理分享的是能够抵抗免疫检查点的CART，具体内容如下： 设计思路：让T细胞表达识别肿瘤抗原的CAR的同时，让T细胞再额外表达PD-1抗体的scFv段，通过PD-1 scFv段阻断免疫细胞PD-1和肿瘤细胞PD-L1的互作，解除免疫抑制作用！相较PD-1单抗疗法给药后抗体全身分布，这种PD-1 CART可实现对肿瘤的精确打击，只在肿瘤部位分泌“PD-1”，避免在其他部位产生毒副作用  CAR的表达情况及PD-1 scFv的分泌情况：传统CAR（19m28mZ、4H11m28mZ）培养上清中不会检出c-myc标签（PD-1 scFv上带了c-myc标签），PD-1 CAR（19m28mZ/RMP1-14、4H11m28mZ/RMP1-14）培养上清中可检出PD-1 scFv，说明成功制备了PD-1 CART及对照组  选了EL4（淋巴瘤）和ID8（卵巢瘤）两种肿瘤细胞，两种肿瘤细胞IFN-γ刺激后PD-L1表达上调  所制备的CART能特异的对肿瘤细胞产生反应：分泌细胞因子、杀伤肿瘤细胞  验证scFv的功能：19m28mZ/RMP1-14组可分泌PD-1 scFv，分泌出的scFv可结合到CART细胞本身，竞争性抑制PD-1检测抗体的结合，降低PD-1+细胞的检出率  验证scFv的功能：分泌出的scFv除可以结合到分泌细胞本身外，还可以结合到“旁观者”   In vivo验证PD-1 scFv的分泌：小鼠种腹水瘤，40天后灌注CART，48小时后检测腹水中scFv段，可见引入了scFv的CART细胞组均能检测出c-myc标签，说明PD-1 CART细胞在体内可正常分泌PD-1 scFv  PD-1 CART相较传统CART可显著延长腹水瘤小鼠存活时间  PD-1的引入可增强CART的persistence：存活大于120天的小鼠骨髓内仍可通过PCR检出CAR  还是看persistence：PD-1 CART更能耐受二次种瘤  PD-1 CART活性为啥那么好，原来除了CART细胞自身受益于PD-1 scFv外，内源T细胞也受益了 - PD-1 CART组内源T细胞激活、细胞因子水平较传统CART组高  前面做的是小鼠的PD-1，开始筛人的：比较三种抗体对PD-1的结合能力（a），根据3种抗体设计scFv段，比较不同的scFv段在血液中的稳定性（b，c），选取E27进一步研究  设计新的CAR：CAR的表达情况及PD-1 scFv分泌情况  In vitro验证CART的功能：PD-1 CART分泌的scFv可结合到PD-1+的细胞上（g，h），所有CART均可特异的裂解表达对应抗原的肿瘤细胞（i）  相较传统CART组（1928z），PD-1 CART（1928z-E27）杀伤肿瘤细胞的能力更强  相较传统CART组（1928z），和肿瘤细胞共培养后，PD-1 CART（1928z-E27）增殖能力更强  PD-1 CART（1928z-E27）分泌的PD-1 scFv可结合自身的PD-1，竞争性抑制检测抗体的结合，“降低”PD-1水平  不同的CART和T细胞共培养后检测scFv：PD-1 CART（1928z-E27）分泌的PD-1 scFv除可结合自身外（自分泌），还可结合到CAR-的T细胞上（旁分泌）  PD-1 CART细胞和PD-L1+的肿瘤细胞共培养后扩增能力显著增强  PD-1 CART显著延长血液瘤小鼠的存活时间  PD-1 CART显著延长实体瘤小鼠的存活时间，且作用优于CART和PD-1抗体联用  PD-1 CART旁分泌scFv作用可增强传统CART作用，延长小鼠存活时间：SKOV3-PDL1肿瘤只能被4H1128z CART识别，1928z-E27 CART无法识别这个肿瘤细胞，但它分泌PD-1 scFv支援4H1128z CART细胞  前面的数据说明scFv的引入可增强CART的作用，初步说明PD-1 CART由于CART和anti-PD1联用，PD-1 CART的另一优势在于CART可识别肿瘤部位，讲PD-1阻断只限定在肿瘤位置，避免全身扩散，引起不必要的毒副作用：小动物活体成像显示PD-1 CART分泌的scFv只局限于肿瘤部位，而注射的PD-1抗体全身分布  检测血清中的抗体或scFv段后也显示PD-1 CART分泌的scFv段具有肿瘤靶向性，血清中含量很低，而PD-1抗体在血清中浓度较高 文章作者管这种CART叫armored CART，分泌的PD-1 scFv在给自己穿上抵御肿瘤细胞PD-L1攻击的盔甲的同时还能给内源T细胞也穿上盔甲，不同于PD-1抗体的全身弥散，PD-1 CART只在肿瘤部位起效，闹的动静并没那么大，因此毒副作用更小。不同的设计思想来源于设计者信息背景的不同以及信息处理模式的不同，信息的交汇、精炼产生知识，能旁观这个过程很幸福...... Rafiq Sarwish,Yeku Oladapo O,Jackson Hollie J et al. Targeted delivery of a PD-1-blocking scFv by CAR-T cells enhances anti-tumor efficacy in vivo.[J] .Nat. Biotechnol., 2018.想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

免疫检查点很热，外泌体也很热，此次分享的文章将两大热点联系到了一起，发现外泌体（EV）表面表达PD-L1，可发挥免疫抑制作用。分析临床病人后发现外泌体PD-L1水平和免疫检查点单抗药物响应率存在相关性，具体内容如下：差速离心分离纯化出原发或转移型黑色素瘤病人血液中的外泌体（EV）后用电镜、纳米粒度仪表征反向蛋白芯片、WB分析原发型及转移型黑色瘤病人的全细胞（W/WCL）、外泌体（E/EXO）后发现：转移型肿瘤病人血液中外泌体PD-L1含量更高（两类肿瘤细胞PD-L1含量无差异）换一种外泌体分离方法-密度梯度离心法制备外泌体后也确证外泌体含PD-L1（严谨！连外泌体制备方法都尝试多种）囊泡（MV）也含PD-L1，但比外泌体含量低，再结合前面两种细胞总PD-L1含量无差异而外泌体PD-L1含量有差异的数据，暗示外泌体PD-L1值得关注 蛋白芯片、WB的数据只能说明外泌体含PD-L1蛋白，但无法判断PD-L1在外泌体上表达的位置，免疫金法发现外泌体PD-L1表达于外泌体膜表面ELISA法也确证PD-L1表达于外泌体表面，另一方面肿瘤细胞受IFN-γ刺激后PD-L1表达水平会升高，ELISA、WB检测发现INF-γ刺激的肿瘤细胞分泌的外泌体PD-L1水平也升高表达PD-L1的外泌体可与PD-1结合：IFN-γ刺激的细胞分泌的外泌体PD-L1水平高，结合的PD-1多；PD-L1抗体可阻断外泌体和PD-1的结合，暗示外泌体表面的PD-L1保留着和PD-1互作的功能细胞分泌外泌体有相应的通路（ESCRT），沉默通路中关键的蛋白Hrs后外泌体PD-L1水平降低 - 在反向验证，PD-L1是“有意”装载在外泌体而非偶然“沾”上的外泌体分泌通路中关键蛋白Hrs、外泌体marker CD63可与PD-L1互作（IP、共定位），更进一步说明外泌体表达PD-L1是细胞“有意为之”的沉默调控外泌体释放的关键蛋白Rab27后在全细胞（WCL）PD-L1水平升高，外泌体（EXO）PD-L1水平降低，暗示细胞中绝大部分PD-L1通过外泌体“放出去执行任务了”In vivo验证：种瘤小鼠分泌的外泌体才表达PD-L1，且表达量和肿瘤大小正相关，说明肿瘤细胞在体内可分泌表达PD-L1的外泌体人的In vivo数据：分离出健康人（HD）、黑色素瘤患者（MP）的外泌体、囊泡，发现主要是外泌体表达PD-L1，且肿瘤患者外泌体PD-L1水平更高，外泌体是造成健康人和肿瘤患者PD-L1水平差异的决定性因素感受性曲线（ROC）分析显示外泌体PD-L1水平可区分健康人和肿瘤患者前面那么大的篇幅严谨的说明了肿瘤细胞分泌的外泌体表达PD-L1，可与PD-1互作。生理条件下是表达PD-L1的肿瘤细胞和表达PD-1的T细胞互作后抑制T细胞的功能，开始研究PD-L1外泌体的功能：第一步，PD-L1外泌体可与CD8 T细胞互作（CFSE标记的外泌体和CD8 T细胞共定位）流式方法从更有统计学意义的角度说明PD-L1和CD8 T细胞发生了互作证明了PD-L1外泌体可与CD8 T细胞互作之后，在研究PD-L1外泌体对T细胞功能的影响之前，文章作者构建了工具细胞系：MEL624细胞本身不表达PD-L1，分泌的外泌体也不表达PD-L1，外源性地让MEL624表达PD-L1，表达了PD-L1之后的细胞分泌的外泌体也表达PD-L1了 In vitro：表达PD-L1细胞分泌的外泌体可抑制激活的CD8 T细胞的增殖、细胞因子的分泌，PD-L1抗体可rescue外泌体对CD8 T细胞的抑制作用In vitro：换个黑色素肿瘤细胞系再次验证PD-L1外泌体对CD8 T细胞的抑制作用In vitro：肺癌、乳腺癌的细胞系也会释放表达PD-L1的外泌体，这些外泌体也能够抑制CD8 T细胞的功能In vitro验证PD-L1外泌体的功能之后开始in vivo验证：小鼠接种敲除了PD-L1的肿瘤，给予PD-L1外泌体会促进肿瘤细胞的生长，在给予PD-L1外泌体的同时给予PD-L1抗体则能够阻断部分促瘤作用In vivo深入探究发现PD-L1外泌体抑制了PD-1+ CD8 T细胞的功能，PD-L1抗体可缓解抑制作用 In vivo深入探究发现PD-L1外泌体抑制CD8 T细胞对肿瘤的浸润，PD-L1抗体可缓解抑制作用小鼠in vivo模型上看到了PD-L1外泌体对肿瘤免疫的抑制作用，开始看临床病人的in vivo，比对anti PD-1疗法响应与否的病人发现：响应者与非响应者总体PD-L1水平无差异，只有外泌体PD-L1水平存在差异外泌体PD-L1水平高的病人对anti PD-1疗法客观响应率（OOR）低，外泌体PD-L1水平和肿瘤病人IFN-γ、肿瘤负荷正相关分析病人外泌体PD-L1含量的变化，在第6周达到峰值 囊泡上PD-L1第6周也达到峰值，但增量不如外泌体上多外泌体上PD-L1达到峰值后，PD-1+ CD8 T细胞增殖受阻 在前3-6周外泌体PD-L1增量越高对anti-PD1疗法越响应进一步分析，当外泌体PD-L1增量达2.43时和客观响应率相关性最好（PD-L1总水平、非外泌体PD-L1水平和客观响应率相关性不大）笔者看到的外泌体高分文章关注的大多都是外泌体中非编码RNA的生物活性，大海捞针一样找到外泌体中某些核酸片段。这篇文章则很轻巧 - 外泌体大家都很熟悉、免疫检查点肿瘤免疫大家也很熟悉，可就是没人发现两者之间的相关性，作者不拘泥于基础研究只在动物模型上验证，还去临床找样本、抓数据，理论价值、现实意义都很深远，思维简单朴素、平凡伟大！ Gang Chen, Alexander C. Huang, Wei Guo et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. [J] . Nature, 08 August 2018. 想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

       CAR-T是在搞清楚TCR的工作模式之后简化而来的，一代CAR-T没有共刺激段激活T细胞的能力相对较弱，二代引入共刺激段后能高效激活T细胞，但也带来了细胞因子风暴等副作用！在CAR-T、TCR-T之间，研究者又设计出TAC-T（T cell antigen coupler） – 在T细胞表面表达一个肿瘤抗原识别受体，该受体识别抗原后把TCR“拽”过来，通过TCR但不依赖MHC分子地激活T细胞，具体内容如下：TAC设计：T细胞的激活是依赖TCR、CD4/8共受体和MHC I/II分子形成的复合物，文章作者的思路是模拟CD4/8和TCR互作模式的同时将肿瘤抗原识别的任务交给TAC，这样就可以不依赖MHC分子的条件下识别肿瘤抗原，识别后 TAC上的CD3结合域可以和TCR互作从而激活T细胞首先设计了识别肿瘤抗原HER2的TAC，进行CD3结合域的构效研究：选取了2个识别不同CD3表位的抗体scFv段，不同的TAC在细胞表面表达水平相当UCHT1的scFv作TAC上的CD3结合域对TAC-T贡献更大：抗原刺激后细胞因子分泌更多、细胞毒性更强又设计了识别肿瘤抗原CD19的TAC，进行CD3结合域的构效研究：人源的UCHT1表达水平更高huUCHT1和F6A的scFv对TAC-T的贡献相当（抗原刺激细胞因子生成、细胞毒性），选取huUCHT1作为TAC上的CD3结合域正向的看完不同的CD3结合域对TAC-T的贡献不同之后开始反着看，设计了不能结合CD3的变体△UCHT1：失去CD3结合功能的TAC-T无法响应抗原刺激生成细胞因子、发挥细胞毒作用，说明CD3结合域对TAC的必要性TAC模拟的是CD4/8、TCR共受体模式，前面验证的是CD4比较一下TAC上用CD4或CD8段的异同：表达水平、细胞因子生成、细胞毒性上无差异只有抗原刺激才能引起TAC-T的反应：生成细胞因子、发挥细胞毒作用In vitro验证TAC-T之后开始in vivo验证：TAC-T能够快速抑制HER2实体瘤的生长In vivo，TAC-T能够抑制CD19血液瘤的发展验证了TAC-T的有效性之后开始和CAR-T进行比较：静息状态下TAC-T exhaustion marker（PD-1、LAG-3、TIM3）的表达水平更低用CD45RA和CCR7两个marker比较TAC-T和CAT-T在静息状态下的分化情况：TAC-T na?ve亚型比例较CAR-T高，而终末分化到effector memory亚型低，说明TAC-T静息分化水平低TAC-T共刺激受体CD27/28的表达水平较CAR-T高比较分子、细胞水平的差异之后比较功能上的差异：in vitro，TAC-T和1代CAR-T无差异（抗原刺激细胞因子生成能力、细胞毒性）比较分子、细胞水平的差异之后比较功能上的差异：in vitro，TAC-T和2代CAR-T无差异（抗原刺激细胞因子生成能力、细胞毒性）比较分子、细胞水平的差异之后比较功能上的差异：in vivo，TAC-T抑制肿瘤生长的作用优于CAR-T（1代、2代），此外2代CAR-T会明显降低小鼠体重，而TAC-T不会，暗示除活性更优外，TAC-T的毒性更低HE、IHC染色发现TAC-T浸润到肿瘤部位能力更强安全性方面，CAR-T出现了更严重的off tumor现象，会浸润到肺部和心脏对组切片再进行多色免疫荧光检测也确证了HE、IHC的结果：相较CAR-T，TAC-T对肿瘤组织浸润能力更强，但不会浸润的正常组织，说明其安全性TAC-T或CAR-T灌注后检测血液中细胞因子含量，发现TAC-T不会像CAR-T那样显著提高血中细胞因子含量，暗示细胞因子风暴风险更低，还是说明了TAC-T的安全性优于CAR-T       CAR-T是科学家弄清T细胞的工作模式之后，完全脱离T细胞原有模式自己“玩”自己的，出现的问题是1代太弱（活性不够），而2代太强（毒性太高）！为降低CAR-T毒性，有各种各样的改造策略，TAC-T则另辟奇径，采取的策略是给T细胞自身的TCR接一根识别肿瘤抗原的“导火索”，不依赖MHC的调动TCR，用T细胞本来的信号引起T细胞的反应 – 更本来、轻灵！Christopher W. Helsen, Joanne A. Hammill, Vivian W.C. Lau et al. The chimeric TAC receptor co-opts the T cell receptor yielding robust anti-tumor activity without toxicity.[J] . NATURE COMMUNICATIONS, 2018.         想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

       哈喽，大家好！小G又回来啦～这次回归可不是空手而归，而是给大家带来了满满的知识。除了即将推出《G课堂第二季》以外，我们还为大家准备了各种实验操作视频，让大家更加了解仪器的操作。       本期我们带来的是AKTA操作软件Unicorn™ 的支持视频。       最近小G发现，身边的很多同学在分析纯化实验结果的时候，都只是根据出峰形状来判定实验结果的好坏，其实这样是不完整的。一般来说，我们除了会根据形状来判断大致的结果，还要在纯化的步骤当中对每一个组分进行定量，进而判断收率。不仅是层析实验，各种实验的定量都非常关键。定量不仅让您获得更精确的结果，也更加容易发现问题的所在。       那么我们今天就通过视频来给大家介绍一下如何通过Unicorn™ 7软件来计算层析峰面积。【点击网址查看视频：https://v.qq.com/x/page/u0735ixhl5j.html】       怎么样，是不是很简单 :) 。使用Evaluation Classic版本的小伙伴在软件中的峰面积分析也是非常简单，而且具有更强大的分析功能。详细步骤可以联系支持发送相关步骤文档。现在就来亲手试试吧！       下周我们依然会带来Unicorn™ 7 软件的使用指导视频，我们不见不散！        AKTA pure 与 AKTA avant现已标配 Unicorn 7.1+，详细信息请扫描下方二维码或联系区域支持与销售。北京德泉兴业商贸有限公司为GE healthcare北京及山东科学仪器独家授权现已提供全线产品支持，欢迎来函及致电：

此次分享的是一种新的技术组合，将人们熟知的技术：电穿孔、同源介导修复、CRISPR Cas9放到一起编辑T细胞，具体如下：DNA链对于细胞是有毒性的，会降低细胞活力，不同类型的DNA链毒性不同：ssODN-寡聚脱氧核苷酸、RNP-CRISPR Cas9核糖核蛋白、Plasmid-质粒、dsDNA-线性双链DNA作者的策略是在要导入的序列两端加入与整合位点同源的序列，利用细胞自带的同源介导修复机制（HDR-用于修复细胞内偶发的DNA损伤）将新片段定点整合到基因组中以降低毒性RNP + dsDNA HDR + 电穿孔的方法能够高效、安全的把GFP序列导入并表达验证通用性：新方法能有效用于各种类型的样品验证通用性：设置不同的位点，导入GFP，细胞层面没问题，可以表达GFP验证通用性：设置不同的位点，导入GFP，不同位点对应的亚细胞定位不同，显微镜空间角度验证-GFP的表达位置和靶序列对应蛋白亚细胞定位一致BATF是个转录因子，会结合到特定的DNA位点，CUT＆RUN法（类似CHIP的方法）验证GFP和BATF一起定位到了BATF结合的DNA位点，暗示新方法准确的将GFP基因整合到了BATP基因选取匹配的同源序列，如上图，用CD4同源序列新方法可以“靶向”编辑混合细胞中的特定细胞亚群CD4 T细胞，不影响CD8 T细胞（RAB11A两种细胞都表达，用它的同源序列转CD4和CD8都会表达GFP）可将两个不同基因同时导入一个位点可将两个不同基因同时导入同一个细胞的不同位点可将3个不同基因同时导入同一个细胞的不同位点前面只是单方面的看到了可把目的序列靶向整合，但是否存在脱靶不知道，用targeted locus amplification (TLA) sequencing看是否会脱靶-无脱靶RNP（CRISPR Cas9）的作用是切开靶序列，做了“脱靶”的RNP，发现即便切开了错误的位点，但由于同源介导修复模板（HDRT）的存在也不会发生脱靶前面是以GFP为模型从各个角度证明方法的有效性，可用于编辑基因，开始在别的模型上看该方法用用于治疗疾病的可能：关注IL2受体突变，这个突变会造成IL2受体表达降低，IL2功能受限设计HDR能够校正IL2受体表达缺陷校正IL2受体后，IL2信号得到恢复换一个模型看该方法的能用于治疗：让T细胞表达识别特异抗原的TCRIn vitro，编辑出的TCR-T能够响应肿瘤细胞刺激分泌细胞因子、杀死肿瘤细胞In vivo，编辑出的TCR-T能够抑制肿瘤生长 没有什么新的点，只是把旧有技术做了一个组合（同源介导修复、CRISPR Cas9、电穿孔），但故事讲的好 - 以病毒介导整合的随机性、DNA的“毒性”为起点，接着多个角度证明方法的有效性，最后将方法和实际结合，落脚在当下的热点肿瘤免疫！技术和发现就在那里，决定高度的是你能看多远...... Theodore L. Roth, Cristina Puig-Saus, Ruby Yu, Eric Shifrut, Alexander Marson et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.[J] .Nature, 2018.想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

1.毕导这篇阅读量迅速突破十万加的公众号，无心插柳柳成荫，让我司代理的biotage产品蹭了一大波热度，评论为证。让我不得不感叹我们公司公众号永远三位数的阅读量。请高抬贵手，多多关注，里面有biotage过柱子的详细内容.2.不得不提的是，毕导用的这张图，和我去年暑期培训做的ppt用的一幅图，都是从百度的犄角旮旯里面找出来的，不同的是，我的ppt，至今只被几十个人看到了。3.评论里面那个小伙子，你说我们biotage过柱子太快，一天能过几十根(手动过柱子有的时候要几天过一根)，我承认。你说我们吸不上乙醚，我就要过去给你比划比划了，我们可是用这个优势干掉过竞争对手的。你说洗柱子太麻烦，我们去年就已经推出了柱效高，成本超低的一次性柱子，装柱子那几分钟的过程都给你省了，欢迎垂询。4.那个网名123的微友，您说话要负责任啊，毕竟一万刀已经远远低于我们现在的成本价了，您这让我们公司以后咋卖产品了。您是不是我们biotage十几年前的老用户，毕竟房价涨了十倍，我们仪器才涨了三四倍，现在的仪器长这样。5.评论中的顾云，是我们厂家上海总部的应用专家，经常帮忙解决我们很多客户的疑难杂症，过不开柱子了就找我，我帮你联系他，九零后的帅哥一枚，天天五大洲四大洋的跑，神龙见首不见尾，不好找。还有毕导太过分了，我们想发到自己的公众号，就要我们一台biotage，截屏总可以吧。或者您帮我们卖十台，我们送您一台样机可以吗。

什么是CRISPR最近几年，CRISPR技术发展如火如荼，一直是角逐诺奖的大热门。CRISPR全称为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，规律成簇的间隔短回文重复，是大多数细菌及古细菌中一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas原本是细菌抵御病毒的重要武器，而现在它已经成为了基因组编辑的强大工具。风头正劲的CRISPR/Cas不仅操作简便，而且还有很强的可扩展性，被广泛应用到各种生物中，催生了大量的研究成果。CRISPR导入方式的对比作为基因编辑技术的弄潮儿，CRISPR/Cas系统具有巨大的潜在应用。然而CRISPR技术并不复杂，将质粒高效导入离体细胞或活体内是关键所在。对比几种常用的转染方法，可以发现电穿孔法操作简便、重复性好、高效低毒，已经成为CRISPR复合体导入细胞（如哺乳动物细胞、细菌、真菌、植物细胞、寄生虫和昆虫细胞）的最佳选择。特点电穿孔法试剂法显微注射/基因枪病毒法转染效率高是是（有限细胞类型）是（有限细胞类型且低通量）是（有限细胞类型）结果可重复是是（有限细胞类型）否是（有限细胞类型）单次实验成本低是否（试剂昂贵）是否（试剂昂贵）适用于所有细胞是否否否适用于所有质粒是否否否操作简便是否（实验准备复杂）否（费时费力，需要技巧）否（实验准备复杂）BTX产品助力CRISPR研究BTX是美国著名的细胞融合、电穿孔仪的生产厂家。自从1983年发布第一款商用电穿孔仪，BTX只注重于电穿孔和电融合产品的开发，一直走在电穿孔技术的前沿。BTX电穿孔系统适用于各种类型的CRISPR应用，包括贴壁/悬浮细胞、原代细胞、干细胞、神经元细胞、免疫细胞、受精卵、子宫、卵内、胚胎、活体组织等。应用举例如下：*应用于遗传改造中国科学院动物研究所的王皓毅研究员等证实，使用BTX电穿孔来导入CRISPR/Cas9系统，不仅使得CRISPR/Cas9能够高效地实现实验室小鼠遗传改造，并且可显著提高这一系统的通量（Qin W, et al. Genetics, 2015.）。*应用于胚胎/活体基因编辑研究借助BTX产品，中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所杨辉研究组等成功设计了一种以HMEJ为基础的基因敲入策略，在多种系统（体外培养的细胞、动物胚胎和体内组织）中均比现有的基因敲入策略效率高（Xuan Y, et al. Cell Research, 2017.）。*应用于基因组学研究应用BTX电穿孔系统，清华大学化工系生物育种技术与装备团队报道了一种基于 CRISPR/dCas9 敲低技术 (CRISPRi) 的新型细菌功能基因组学方法，可以一次性研究细菌中数千个基因和特定表型的关系（Wang T, et al. Nature Communications, 2018.）。 更多研究者选择的电穿孔系统经过35年的市场考验，BTX产品在全球各地得到广泛验证和认可，有超过10000篇文献的应用基础，提供海量应用程序、使用指南和解决方案。近一年内，使用BTX产品在Nature及子刊上发表的部分CRISPR相关Paper请在文末查看.BTX电穿孔系统选型指南高配系统：Gemini X2适用于任何类型细胞——提供方波和指数衰减波7英寸触屏操作，预置大量程序，包括CRISPR预设程序海量数据记录，无限量存储用户自定义程序，可实现更快参数优化可与电极杯、活体电极、高通量电极室等配合使用 经典系统：ECM830灵活而高效的方波电穿孔系统7英寸触屏操作，预置大量程序助力CRISPR技术，大量文献应用记录可与电极杯、活体电极、高通量电极室等配合使用1.Glasgow S M, Carlson J C, Zhu W, et al. Glia-specific enhancers and chromatin structure regulate NFIA expression and glioma tumorigenesis[J]. Nature Neuroscience, 2017, 20(11):1520.2. Guérin A, Corrales R M, Parker M L, et al. Efficient invasion by Toxoplasma depends on thesubversion of host protein networks[J]. Nat Microbiol, 2017, 2(10):1358.3. Salvatore I, Javier D, Jillian I, et al. The CaMKII/NMDA receptor complex controls hippocampal synaptic transmission by kinase-dependent and independent mechanisms[J]. Nature communications, 2018, 1:2069.4. Jiang W, Zhu T F. Targeted isolation and cloning of 100-kb microbial genomic sequences by Cas9-assisted targeting of chromosome segments[J]. Nature Protocols, 2016, 11(5):960-975.5. Kwart D, Paquet D, Teo S, et al. Precise and efficient scarless genome editing in stem cells using CORRECT[J]. Nature Protocols, 2017, 12(2):329.6. Huang J, Chen M, Whitley M J, et al. Generation and comparison of CRISPR-Cas9 and Cre-mediated genetically engineered mouse models of sarcoma[J]. Nature Communications, 2017, 8:15999.7. Reijnders M, Kousi M, Van G W, et al. Variation in a range of mTOR-related genes associates with intracranial volume and intellectual disability[J]. Nature Communications, 2017, 8(1).8. Wang T, Guan C, Guo J, et al. Pooled CRISPR interference screening enables genome-scale functional genomics study in bacteria with superior performance[J]. Nature Communications, 2018, 9:2475.9. Xie Z, Pang D, Wang K, et al. Optimization of a CRISPR/Cas9-mediated Knock-in Strategy at the Porcine Rosa26 Locus in Porcine Foetal Fibroblasts[J]. Sci Rep, 2017, 7(1):3036.10. Ikeda M, Matsuyama S, Akagi S, et al. Correction of a Disease Mutation using CRISPR/Cas9-assisted Genome Editing in Japanese Black Cattle[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1).11. Guérin A, Hajj H E, Penaretevargas D, et al. RON4 L1 is a new member of the moving junction complex in Toxoplasma gondii[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1).12. Sidik S M, Huet D, Lourido S. CRISPR-Cas9-based genome-wide screening of Toxoplasma gondii[J]. Nature Protocols, 2018, 13(1):307.13. Wallis A M, Wallace E C, Hostager B S, et al. TRAF3 enhances TCR signaling by regulating the inhibitors Csk and PTPN22[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1):2081.14. Xuan Y, Xing W, Hu X, et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9[J]. Cell Research, 2017, 27(6):801.15. Eyquem J, Mansillasoto J, Giavridis T, et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection[J]. Nature, 2017, 543(7643):113.

暑假来啦，世界杯正热，可我们就是这么任性的为流式细胞术打call！流式细胞术的热度现在不断提高，火热程度堪比这暑伏的烈日，客户对于流式细胞术原理、应用及实验技巧等产生了浓厚的兴趣，在了解到客户的需求后，我们顶着酷日也要奔赴现场带流式细胞术的粉丝们走进它的世界。这次讲的是厉害的流式细胞术在植物研究中的应用哦！7月4日我们的团队准时来到北京林业大学，于博和现场的流式粉丝们一起探讨了流式细胞术的原理、流式细胞术在植物dna含量分析中的应用、流式细胞术在植物研究中的其他应用等几方面的内容，大家热情高涨，展开了激烈的讨论，流式细胞术的魅力就是这样势不可挡。这次林大之行圆满成功，还要感谢林木育种国家工程实验室和生物科学与技术学院等老师们的大力支持，我们的流式细胞术打call之路还会一直持续。流式细胞术就是这么强大吧！如果您也心动啦，下一站有可能我们就在您身边哦~010-83834948~北京德泉市场部随时欢迎您的来电。最细致的服务，最贴心的交流，北京德泉与您相约！

CAR-T细胞疗法已广为人知，效果喜人！但CAR-T细胞的制备依赖于患者自体T细胞，无法做到“现货”供应，NK细胞具有MHC非限制性的杀瘤功能，此次整理分享的内容是将CAR（嵌合抗原受体）安装到NK细胞上以增强NK细胞的抗肿瘤作用，具体如下：作者先筛CAR：识别抗原mesothelin的scFv段结合不同的跨膜、胞内段做成不同的CAR表达于NK92细胞系，不同的CAR在NK92上表达水平相当所用到的肿瘤细胞系mesothelin表达水平：有高有低，以便比对特异性不同的CAR-NK92体外裂解肿瘤细胞的能力不同不同的CAR-NK92 体外肿瘤刺激后脱粒marker CD107a表达水平不同所筛选的CAR有的是NK细胞专属CAR（根据NK细胞信号传导结构基础设计的，如NKG2D是源于NK细胞表面NKG2D受体），有的直接用的T细胞的CAR，选取NK专属CAR4和源于T细胞的T-CAR（差异主要在跨膜段和共刺激段），比较两种CAR“装在”NK细胞上之后功能的差异：T- CAR在NK92上表达水平相对高一点尽管T-CAR在NK92上表达水平稍高，但NK专属的CAR4表达于NK92之后得到的CAR-NK抗肿瘤作用更强：特异性裂解靶细胞、脱粒表达于细胞表面的CAR起的作用是感知外界，将信号传递到细胞内部，让细胞产生相应的变化，看CAR激活后信号的传递情况：专属CAR4比T-CAR更能灵敏的感知肿瘤抗原、传递信号从NK专属CAR中筛选出了CAR4，也确定专属的CAR4优于T-CAR，开始进一步的“构效”研究：将参与信号传递的跨膜段、共刺激段、胞内信号段进行点突变，看点突变对于CAR-NK功能的影响，首先点突变并不显著影响CAR的表达水平裂解靶细胞角度：跨膜段NKG2D、共刺激段2B4点突变后CAR-NK裂解靶细胞的能力明显降低，暗示这两部分对于细胞功能贡献大 效应分子角度：跨膜段NKG2D、共刺激段2B4点突变后CAR-NK接受抗原刺激后脱粒、分泌干扰素的能力降低，再次暗示跨膜段、共刺激段两部分对于细胞功能贡献大CAR激活后信号通路角度的数据也说明跨膜段、共刺激段对于抗原诱导NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力很关键前面用易得的NK细胞系NK92进行了筛选研究，确定了NK专属的CAR4不错，但NK92细胞系存活、增殖方面存在不足，文章作者设计使用诱导多能干细胞作为“原料”生产NK细胞iPSC诱导产生的NK和外周血NK细胞表型一致，表达不同的CAR之后表型并不受影响验证以iPSC为原料生产的CAR-NK的作用：特异性的、高效的对肿瘤抗原产生反应，裂解靶细胞、脱粒验证以iPSC为原料生产的CAR-NK的作用：肿瘤抗原刺激后CAR-iPSNK特异性的高效激活相关信号通路In vitro比对CAR-NK和CAR-T：CAR-NK在体外表现出了优于CAR-T的裂解肿瘤细胞的能力In vivo：NK专属的CAR4较T-CAR能加能够增强CAR-NK的抗肿瘤作用，延长小鼠存活时间看in vivo的peresistence对比CAR-T和CAR-NK：CAR-NK起效更快，抑瘤作用更强CAR-NK较CAR-T更能延长荷瘤小鼠存活时间CAR-T会引起小鼠体重下降，进一步分析脏器发现：CAR-T会造成脾肿大，淋巴细胞浸润到各个脏器，CAR-NK则不会，暗示CAR-NK毒性更低分析细胞因子：CAR-T治疗组小鼠血中细胞因子浓度在注射后20天依然维持高水平，而CAR-NK则不会，暗示CAR-NK细胞因子风暴风险较低 一切其实都是联系的，之前分享过把肠道微生物和肿瘤免疫联系到一起的science，这篇是将干细胞和肿瘤免疫联系到了一起，更进一步又把CAR-T模式移植到了NK细胞上！这移植不是简单的移植，而是充分考量NK细胞的特性，由NK细胞的NKG2D受体等演化出跨膜段和共刺激段！世上本没有路，走的人多了才有的路，但是，那路是别人的路，走别人的路容易迷路…… Ye Li, David L. Hermanson, Branden S. Moriarity, Dan S. Kaufman. Human iPSC-Derived Natural Killer Cells Engineered with Chimeric Antigen Receptors Enhance Antitumor Activity [J]. Cell Stem Cell, 2018.想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

针对前列腺癌会采取雄激素剥夺疗法，但病人经常会出现耐受。研究者通过比较对此疗法敏感和耐受的病人样品发现了产生耐受的机制：骨髓来源的抑制性细胞（MDSC）分泌IL-23激活雄激素相关通路促进肿瘤细胞存活。具体内容如下：比较对疗法敏感（CSPC）和耐受（CRPC）病人的样品：耐受病人EpCAM+肿瘤细胞旁PMN-MDSC浸润增加。作者假设耐受与MDSC浸润相关，所以在不同小鼠肿瘤模型上进行了验证Pten PC-/-小鼠阉割后（CTX – 相当于雄激素剥夺）肿瘤生长减缓，但到t=8时肿瘤又开始加速生长，暗示出现了耐受对雄激素通路相关基因分析：阉割疗法敏感组（CS）雄激素通路基因表达在阉割后出现下调，而阉割疗法耐受组（CR）雄激素相关基因表达上调 - 没有雄激素了，但相关基因依然表达，暗示有其他“贡献物”伴随着耐受的发生，肿瘤浸润MDSC增加对肿瘤部位免疫细胞进一步分析：MDSC是肿瘤部位免疫细胞的主体，MDSC增加，而巨噬细胞减少 在另外两个肿瘤模型上验证（TRAMP-C1：p53 and RB inactivation and MyC-CaP：MYC amplification)：MDSC浸润增加而巨噬细胞浸润减少到这里其实只发现会出现耐受、MDSC浸润增加，但耐受与浸润增加是否相关还没有明确数据支持，所以作者又设计了实验，用培养过MDSC的条件培养基培养肿瘤细胞：Full androgen deprivation（FAD）后肿瘤细胞增殖减慢、活细胞减少、晚期凋亡细胞增加、雄激素通路相关基因下调，但MDSC条件培养基能rescue雄激素剥夺，暗示MDSC分泌物补偿了雄激素的作用，于耐受存在相关性用MDSC条件培养基作用于另一肿瘤细胞，再次验证：MDSC条件培养基能rescue雄激素剥夺造成的增殖受限前面正向的证明了MDSC浸润和耐受的相关性，开始反向验证：用趋化因子受体抑制剂阻断MDSC的浸润之后耐受组肿瘤生长受抑制、雄激素通路相关基因表达下调（作者还在其他肿瘤模型进行了验证-略）。至此，作者发现MDSC浸润到肿瘤部位促进肿瘤细胞生长，在雄激素剥夺的条件下激活雄激素通路信号前面做了MDSC条件培养基，发现MDSC通过分泌物影响肿瘤细胞，分析肿瘤细胞基因表达，结合文献筛出IL-23Pten PC-/-模型中MDSC表达、分泌IL-23对病人的样品进行检测，发现EpCAM+肿瘤细胞旁的MDSC表达IL-23，且耐受组（CRPC）IL-23表达水平更高耐受病人血液IL-23水平较高，IL-23水平与浸润MDSC正相关MDSC是IL-23的主要贡献者由MDSC角度切换到肿瘤细胞角度：手术阉割（CTX）引起肿瘤细胞趋化因子表达增加（可召集MDSC）阉割后肿瘤细胞表面IL-23受体表达升高至此理出的线索是MDSC浸润到肿瘤部位，分泌IL-23。用抗体“敲掉”MDSC（阻断趋化因子受体，抑制浸润）后能抑制肿瘤生长、延长存活时间，暗示MDSC对肿瘤生长存在正向作用（巨噬细胞无此作用-anti-CSF1R敲的是巨噬细胞）“敲掉”IL-23：肿瘤细胞增殖减缓、活细胞减少、晚凋细胞增加、雄激素通路相关基因表达下调，暗示IL-23对肿瘤生长存在正向作用体外培养雄激素依赖的细胞：雄激素剥夺（FAD）后细胞增殖受限，添加IL-23能rescue增殖受限，暗示IL-23是促瘤“有效成分”初步确定IL-23的作用之后在小鼠模型上验证：IL-23缺陷骨髓移植小鼠肿瘤体积更小，暗示IL-23对肿瘤生长存在贡献In vivo：IL-23敲除组腺体更正常，增殖相对缓慢，雄激素通路基因表达水平更低，暗示IL-23和腺体异常增殖、雄激素通路激活正相关换个肿瘤模型继续验证IL-23对于肿瘤生长、雄激素信号的正向作用又是一个模型，用抗体阻断IL-23信号能达到和敲除类似的效果！IL-23有自己的信号通路，能够影响雄激素信号通路，评估IL-23下游信号：敲除IL-23后，下游信号激活降低阻断IL-23下游的RORγ后可抑制IL-23引起的细胞增殖、阻断雄激素通路相关信号，暗示IL-23通过pSTAT-RORγ信号驱动雄激素信号通路，促进肿瘤细胞的存活、增殖机制搞清了，有什么用呢？临床上已经IL-23的抗体在进行临床试验了，这篇文章的数据支持IL-23抗体和目前的ENZA（雄激素抑制剂）联用：联用后能大幅抑制肿瘤生长组织细胞层面深入研究：联用能显著抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡、抑制雄激素通路基因表达 文章从前列腺癌雄激素剥夺疗法耐受出发，基于文献报道提出猜想，通过比对病人样品开始“故事”，理清了耐受现象细胞、分子层面的机制！底层是追踪科研前沿的同时，紧密结合临床，通过深度挖掘临床样品“讲故事”！其实不但讲了故事，而且为一个已经上临床试验的药物扩大了适用范围 - 背后还有着现实收益！ Arianna Calcinotto, Clarissa Spataro, Elena Zagato, et al. IL-23 secreted by myeloid cells drives castration-resistant prostate cancer [J]. Nature, 2018.想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

肿瘤免疫疗法“火”，肠道微生物也“火”，此次整理分享的是一篇将两者关联起来的文章，必然更“火”！由肠进入肝脏的血液占肝供血的70%，肝脏是“暴露”于肠的各种代谢物的，其中就包括肠共生细菌的代谢物 – 文章作者由这一宏观的视角出发做了一系列工作，具体如下：建模：用抗生素组合ABX（vancomycin, neomycin, and primaxin）“敲掉”肠道微生物（以16S rRNA为指标），ABX并位产生毒性（以转氨酶为指标） ABX抑制肠道微生物后，原发性肝肿瘤模型小鼠肝部肿瘤结节更少ABX抑制肠道微生物后，皮下肿瘤模型，肝转移减少，皮下肿瘤生长不受影响ABX抑制肠道微生物后，脾内肿瘤模型，肝转移减少，肺转移增加 – 暗示ABX能引起肝脏选择性抑瘤 尾静脉肿瘤模型，确证了ABX能引起肝脏选择性抑瘤 开始探索肝选择性的机制：皮下肿瘤模型，ABX引起肝脏CD8+ T和NKT增多 原发性肝癌模型，ABX只引起肝脏NKT增多ABX还能使不同品系的无瘤小鼠肝脏NKT增多 文献报道CXCR6调节NKT在肝脏的生存、聚集，流式检测发现：肝脏NKT几乎都表达CXCR6 调过来看，在肝脏NKT占CXCR6阳性细胞的大多数，ABX并不改变CXCR6阳性细胞的组成 ABX使肝脏CXCR6阳性细胞增加 ABX组分之一万古霉素能提高NKT对抗原的敏感度前面的数据只能证明ABX和肝脏肿瘤抑制相关、ABX和肝脏NKT增多相关，并不能完全说清ABX、肝脏肿瘤抑制、肝脏NKT三者之间的关系，所以建立模型验证三者之间的关系：敲掉T细胞后ABX肝抑瘤作用消失，单独敲掉CD8+ T ABX肝抑瘤作用不受影响，暗示ABX是通过NKT发挥肝脏抑瘤作用的敲NK反向验证，证实ABX通过NKT发挥肝脏抑瘤作用换个肿瘤模型，再敲NK，再次验证ABX通过NKT发挥肝脏抑瘤作用的结论 到这，作者发现ABX通过NKT（促进肝聚集、提高对抗原敏感度）发挥肝脏抑瘤作用、NKT基本都表达CXCR6，而CXCR6对NKT在肝脏聚集、生存重要，所以检测ABX处理后NKT CXCR6的表达情况，发现ABX并不改变NKT表面CXCR6的表达量 – 受体不变，细胞数增多，那么变化应该出现在配体上，接着做果然，ABX处理后，肝脏CXCL16表达升高（肺部下降） 查文献 + 实验验证：是LSEC（肝窦状腺上皮细胞）贡献的CXCL16 IHC（蛋白水平）结果也表明ABX促进CXCL16的表达 使用CXCL16能使肝脏NKT增加，至此：ABX促进LCEC表达CXCL16，CXCL16将NKT召集到肝脏发挥抑瘤作用 ABX是抗生素，能够影响肠道微生物，作者用消胆胺阻断肠肝循环切断胆汁酸后发现肝脏CXCR6+细胞和NKT细胞增多（这个和ABX类似），暗示胆汁酸参与免疫细胞的调节 检测ABX对肝脏胆汁酸水平的影响发现，ABX能提高初级胆汁酸，减低次级胆汁酸 初级胆汁酸促进CXCL16的表达，次级胆汁酸抑制，暗示ABX通过调节胆汁酸影响CXCL16的表达 次级胆汁酸能够抵抗初级胆汁酸促进CXCL16表达的作用 关联ABX、胆汁酸、NKT细胞：初级胆汁酸CDCA促进ABX增加肝脏NKT细胞的作用，次级胆汁酸w-MCA则相反关联ABX（Vanco为ABX组分之一）、胆汁酸、抑瘤：次级胆汁酸LCA阻断万古霉素抑瘤作用，加入CXCL16能够抵消，而初级胆汁酸CDCA则促进万古霉素的抑瘤作用 反向验证：在敲掉CXCR6细胞的小鼠上，次级胆汁酸抵抗ABX的作用“失效”，至此，ABX通过影响胆汁酸的水平促进CXCL16的表达，召集NKT细胞到肝脏，发挥抗肿瘤作用 无菌级（GF）小鼠较清洁级（SPF）小鼠肝脏NKT更多，CXCL16表达更高，暗示微生物和肝脏NKT存在关联ABX中含三者抗生素，每种有自己的抗菌谱，分开看每种抗生素对于免疫细胞的影响：万古霉素（Vanco）和头孢哌酮（Cefo）靶向革兰阳性菌文献报道可增加初级胆汁酸降低次级胆汁酸，他们均促进NKT肝聚集，这一结果和前面结论一致ABX中万古霉素（Vanco）降低梭菌属，新霉素（Neo）提高梭菌属水平，两者调节NKT细胞肝聚集的作用恰巧不同，暗示梭菌属在这个过程中发挥一定作用 建立新的模型进行验证：先给予万古霉素，之后停药（Cessation）或喂一种梭菌（C scindens），发现喂食梭菌后肝脏NKT显著减低，暗示梭菌对于肝脏免疫存在反向作用 检测胆汁酸发现喂食梭菌后初级胆汁酸水平降低，而刺激胆汁酸水平升高，解释了梭菌对于肝脏免疫的反向作用 肿瘤模型上验证菌属对于肿瘤免疫的作用 上面所有的实验都是在小鼠身上做的，需要做点人的扩大一下研究意义：初级胆汁酸作用于SK-HEP1细胞后CXCL16表达上调 对临床病人进行分析，发现初级胆汁酸水平与CXCL16表达正相关，次级胆汁酸水平与CXCL16表达负相关，初级/次级胆汁酸比例与CXCL16表达正相关 笔者觉得文章作者视角很高，他站在器官的角度审视问题，发现肝肠的关联之后又将这些和当下的两个热点（肿瘤免疫、肠道微生物）同时建立了关联，环环相扣，理出了肠道微生物通过胆汁酸调节肝脏CXCL16的表达，召集NKT细胞发挥肿瘤抑制作用。理出这条线已然很厉害了，作者又进一步检视临床样品，将在小鼠上发现的分子、细胞行为在人体进行“验证”，扩大了研究的现实意义！ Ma C, Han M, Heinrich B, et al. Gut microbiome-mediated bile acid metabolism regulates liver cancer via NKT cells[J]. Science, 2018, 360(6391):eaan5931.想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！                  

CART疗法取得了阶段性的成功，临床试验取得了喜人的结果！随着对所获取病人样本的深度检测，研究者们从数据中又挖掘出了新的信息！此次整理分享的是一个complete remission的病例 – 从这个病人身上挖掘出了对于CART疗法具有指导意义的信息，具体内容如下：患者为一78岁男性，患有慢性淋巴细胞白血病（CLL），第一次注射CART发生了细胞因子风暴（CRS），给予IL-6阻断剂后得到缓解，随后又进行了第二次CART注射，第二年骨髓内CLL为阴性，第三年骨髓中仍可检出CART细胞，到第五年CLL并未复发 细节 – 多方法、多角度、长时间：监测血液中CAR基因拷贝数、细胞因子、肿瘤细胞数目，CT在宏观水平上监测肿瘤细胞（支撑文档里还有细胞水平的数据，如CART细胞数目变化曲线、血细胞计数等，略） 对于这个病人来讲CR是个好事情，但对于研究者来讲，还需要挖掘CR背后的事情，所以对TCR进行了测序，发现第二次注射CART后出现了一占比很高的克隆 基因层面确定出现一“强势”克隆，细胞层面检测也确证出现了这一单一的TCR克隆，且是伴随CAR的表达上调出现的 CAR基因都是随机整合进基因组的，以往的病例中并未没有这种“强势”单一克隆出现，因此对克隆多样性随时间的变化进行了分析：120天左右时这一单克隆最高 - 和CART治疗进展存在关联 “强势”克隆的CAR基因整合到了TET2基因片段中 CAR序列的插入使得TET2发生了突变：1978位的谷氨酸变成了谷氨酰胺 CAR插入引起TET2突变，突变的TET2酶活性降低（调节去甲基化）TET2参与调节去甲基化，而甲基化参与基因表达的表观调控，因此作者做了测序（ATAC-seq），分析染色质的“可接近性” 表达CAR的细胞（TET2突变细胞）细胞周期、T细胞受体相关基因“打开”表达CAR的细胞（TET2突变细胞）细胞分化相关基因“关闭”表达CAR的细胞（TET2突变细胞）细胞因子IFNγ的基因出现“关闭”趋势  细胞水平检测也证实了ATAC-seq得出的某些基因有“关闭”趋势的结论 对细胞亚型进行分析，发现表达CAR的细胞（TET2突变细胞）分化的确受到了抑制（和ATAC-seq一致），主要为Central memory亚型 验证有病人样本分析出的结论：敲低TET2可重现病人样本细胞分化受限的现象尽管分化受限，但其接受抗原多次重复刺激后增殖能力变强  尽管分化受限，但TET2敲低细胞接受抗原多次重复刺激后细胞因子生产能力更强 尽管分化受限，但TET2敲低细胞细胞毒性更强作者对不同CR病人进行了比较，发现尽管CR这个“结果”相同，但细胞水平上不同个体间实际上是存在差异的 – 很有趣，都是细胞异质性带来的？ 跳出来看，这篇文章其实挺“偷懒”的 - 只是把CART临床试验取得的样本进行了又一次挖掘，分析数据，得到初步结论，再返回去测其他指标或者设计小实验进行验证。方法、工具都没什么新奇的，厉害的是人家不被现有概念、定义束缚，充分利用数据、样本的“思维底层”！真的是：技术和发现就在那里，决定高度的是你能看多远！再发散一下：这篇文章挖掘的是临床试验的数据、样本，其实在医院日常的临床工作中，我们的医生拿到的是数量巨大、背景清晰的人类样本，可目前这些样本只局限用于检测某些疾病相关指标，其他指标并未去挖掘，比如可以测序看基因组、质谱看蛋白质组，将这些指标和病人的背景信息进行关联，从积累的大数据中不知道会得到什么惊喜！Joseph A. Fraietta, Christopher L. Nobles, Morgan A. Sammons et al. Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.[J] .Nature, 2018.想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！

以往的CART都是识别结合表达于肿瘤细胞表面的抗原，此次整理分享的文章，作者设计了识别可溶性抗原的CART细胞，并对CART激活过程中CAR在结构层面的变化进行了研究，具体内容如下：可溶性的CD19能激活CD19 CART细胞（CD69表达上调、细胞因子生成增多） 电泳发现CD19以单体和二聚两种形式存在，再结合前人研究成果，文章作者推测二聚形式的配体可能对受体激活有某种意义 为了验证二聚化配体对于CART激活的作用，文章作者设计了GFP CAR系统，并制备了单体GFP和二聚GFP两种配体 只有二聚化GFP配体能激活CART细胞，暗示配体可能调节受体二聚化 电泳结果显示CAR在未激活状态下以单体和二聚两种形式存在，说明受体自身二聚化并不足以激活产生信号 基于上面的实验结果，作者又设计了两个GFP CAR，分别识别不同的GFP表位，推测单体形式的GFP通过两个表位可以把CAR“拉”到一起 - 配体调节受体二聚化 只表达识别单一表位CAR的细胞无法被单体EGFP激活，但当两种CAR同时表达于细胞后，EGFP即可激活细胞，暗示配体通过调节受体二聚化激活细胞 以钙流为指标看信号激活，显微镜观察发现信号的激活不依赖细胞接触 - 可溶性配体可激活CART细胞 上面达到可溶性配体通过诱导受体二聚化可激活CART细胞，怎么应用这个呢？TGF-β是存在与实体瘤微环境中的免疫抑制分子，如果能设计一个识别结合它的CART，利用TGF-β激活CART细胞岂不就逆转了其免疫抑制作用，文章作者从三个TGF-β单抗中“拆出”scFv段，3个scFv均能阻断TGF-β信号 选取阻断信号能力最强的scFv段设计CAR TGF-β无法在表达TGF-β CAR的细胞上激活其信号（磷酸化SMAD2），反而激活了CART细胞的NFAT和NFkB信号 TGF-β无法在发挥免疫抑制作用，反而促进TGF-β CART细胞激活、产生细胞因子 TGF-β功能被逆转：促进TGF-β CART细胞扩增 TGF-β以同源二聚形式存在，那么它识别结合CAR必然存在以上三种模式：1、把两个细胞“拉”到了一起，2、把同一个细胞两个CAR“拉”到了一起，3、1和2同时存在。这三种模式激活信号对于细胞浓度依赖性不同 用NFAT-EGFP报告系统验证，发现高细胞密度利于CART细胞激活，低密度下CART细胞亦可激活（d：无需细胞间互作） 研究CART细胞被激活后CAR的空间分布：激活后CAR会聚簇 激活后CAR会聚簇与ZAP70共定位（ZAP70定位于膜附近，是TCR的一部分，对于T细胞信号传递起重要作用），暗示CAR聚簇对于细胞激活意义重大 研究影响CAR聚簇的因素：突变胞外连接scFV段和跨膜区肽段中能形成二硫键的半胱氨酸并不影响CAR聚簇 研究影响CAR聚簇的因素：胞内区突变也不影响聚簇，用抑制剂抑制微丝则影响CAR的聚簇，暗示是CAR的聚簇是微丝依赖的 到这里作者发现：1、配体调节受体二聚化，2、受体在缺失配体的情况下二聚化不足以激活信号，3、配体结合受体后受体空间分布发生变化且与信号传递关键蛋白共定位！文章作者推测CAR信号的传递是一种力传导 - 配体与受体结合后引起受体二聚化对受体有个拉力，这个拉力使得位于胞内的信号段伸向胞浆，利于胞内信号段域各种下游分子接触、传递信号 既然是力传导，对于传递力、连接scFv和胞内区的那个“绳子”长短肯定有一定影响，作者设计了两个“绳子”长度不同的CAR，发现长度并不影响CAR的表达水平 以GFP报告系统看“绳子”长度对于TGF-β CART激活的影响：短“绳”更利于力的传导，CART细胞的激活 以细胞因子生成看“绳子”长度对于TGF-β CART激活的影响：短“绳”更利于力的传导，细胞因子的生成 文章作者以不同的视角、巧妙的设计了逆转TGF-β免疫抑制作用的CART！在可溶性抗原这个体系里研究配体（抗原）与受体（CAR）的互作，发现了抗原诱导CAR二聚化、聚簇，通过力传导信号！更进一步发现胞外连接scFV“绳子”长短对于信号传递的意义 - 让我们对CAR的认识变得更加细腻！ Chang ZeNan L,Lorenzini Michael H,Chen Ximin et al. Rewiring T-cell responses to soluble factors with chimeric antigen receptors.[J] .Nat. Chem. Biol., 2018, 14(3): 317-324.想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568！