【CNS前沿文献追踪】 – 靶向HER2新表位的双特异抗体

   双特异性抗体一端识别TCR，另一端识别肿瘤特异性抗原，通过连接T细胞和肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。抗体制备已不是什么难题，难的是寻找肿瘤特异性的抗原，HER2是一类乳腺癌抗原，但正常上皮细胞也会表达HER2，因此靶向HER2的双特异性抗体会引起on targrt，off tumor毒性。此次整理分享的文章作者发现了更加肿瘤特异性的抗原-p95HER2，设计、制备了针对p95HER的双特异性抗体，具体内容如下：

HER2阳性的肿瘤细胞中会有p95HER2亚群，上图为两种分子细胞表达模式图

分析HER2、p95HER2在正常组织的表达情况：IHC和WB两种技术都确认p95HER2在正常组织中没有表达

双特异性抗体设计：抗体分子上有两个识别p95HER2的结构域，1个识别TCR上CD3?的结构域- 2:1模式，这种模式的优势在于单个药物分子更易识别肿瘤细胞，避免在没有识别肿瘤细胞时就识别结合T细胞，引起不必要的T细胞激活；Fc段被突变避免结合到Fc受体上

流式检验双特异性抗体对T细胞、肿瘤细胞的识别：选择性结合到PBMC和表达p95HER2的肿瘤细胞

所设计的双特异抗体会结合到过表达HER2的细胞上（D），作者猜想p95HER2是由编码HER2的mRNA合成的，过表达HER2时在HER2合成过程中也合成了p95HER2，所以发生了D图的问题。为验证猜想，作者更换了载体，用M611A载体过表达HER2，发现双特异性抗体p95HER2-TCB不会再结合过表达HER2的细胞上，再次说明p95HRE2-TCB的特异性

In vitro：p95HER2-TCB可介导T细胞特异性的对表达p95HER2的肿瘤细胞产生反应（激活marker CD25、细胞毒性、细胞因子）

In vivo：小鼠先种表达p95HER2的肿瘤，然后移植PBMC，之后给药。p95HER2-TCB可显著抑制肿瘤生长（B），减少肿瘤细胞（D，IHC检测得到的数据），促进T细胞对肿瘤组织的浸润（E）

目前针对HER2的单抗药物赫赛汀（曲妥单抗）对脑转移的肿瘤无效，作者又测试了双特异性抗体对脑部肿瘤的效果：p95HER2-TCB可抑制脑部肿瘤细胞生长，暗示其具备赫赛汀所不具备的穿过血脑屏障的能力

有效性验证完验证安全性，p95HER2-TCB不会像HER2-TCB一样结合到表达HER2的肿瘤细胞（MCF10A）或正常的上皮细胞（NEC），不会引起T细胞的激活，引起细胞毒作用

接着验证安全性，p95HER2-TCB不会结合心肌细胞，引起T细胞激活，从而对心肌细胞产生毒性

作者想摸索一个双特异性抗体有效引起免疫反应所需肿瘤抗原p95HER2表达水平，这个实验需要在小鼠身上进行，首先对用到的实验素材-病人源肿瘤细胞进行验证：比对原始肿瘤和离体培养一段时间之后的肿瘤p95HER2表达水平的变化，通过H score分析，发现离体培养肿瘤抗原p95HER2的表达水平很大程度上未发生改变，暗示病人源肿瘤素材（PDX）可用

文章作者构建了一个TCR报告系统，当双特异性抗体通过识别肿瘤抗原和TCR将肿瘤细胞（PDX）和表达了TCR荧光报告系统的Jurkat-Luc细胞连接到一起，可检测到光信号，绘制p95HER2-TCB浓度-光信号曲线和p95HER2表达量-光信号曲线，从而计算得到双特异性抗体起效所需要的肿瘤抗原表达水平

找了两个p95HER2表达水平的病人源肿瘤验证，p95HER2-TCB可有效抑制p95HER2表达水平高的肿瘤细胞生长，对p95HER2抗原表达低的肿瘤抑制生长作用不明显，说明评估抗原表达水平对预测双特异性抗体疗效具有指导意义

文章厉害的点在于找到了新的、特异性更强的肿瘤抗原，并且以2:1的模式巧妙设计双特异性抗体。相较小分子，抗体药物在特异性上有着无可比拟的优势 - 它与靶点的互作界面更大，通过精心调整互作界面氨基酸序列更能实现“指哪打哪”的目的。

      Rius Ruiz Irene,Vicario Rocio,Morancho Beatriz et al. p95HER2-T cellbispecific antibody for breast cancer treatment.[J] .Sci Transl Med, 2018.

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