【CNS前沿文献追踪】 – 肿瘤表面的免疫抑制性分子LILRB4

细胞表面表达着各种受体，这些受体用于感知环境变化以使细胞做出相应调整，其中免疫调节受体发挥着至关重要的作用，此次整理分享的文章讲的就是肿瘤表面一种免疫抑制性分子-LILRB4，文章作者深入研究了LILRB4的作用机制，具体内容如下：

从零开始比较难，作者在TCGA数据库中检索、分析免疫调节分子和病人存活率的关系，发现LILRB4的mRNA水平和存活时间负相关

对105个病人样本进行检测，发现LILRB4主要表达于单核细胞和单核急性髓性白血病细胞，且单核急性髓性白血病细胞表达水平更高（AML subtypes by the French-American-British (FAB) classification, acute myeloblastic leukaemia with minimal maturation (M1, n = 9), acute myeloblastic leukaemia with maturation (M2, n = 34), acute promyelocytic leukaemia (M3, n = 10), acute myelomonocytic leukaemia (M4, n = 34), acute monocytic leukaemia (M5, n = 25), acute erythroid leukaemia (M6, n = 2), and acute megakaryoblastic leukaemia (M7, n = 1)），有特异性表达的意思，暗示有作为治疗靶标的价值

将LILRB4阳性（B4+）或阴性（B4-）的肿瘤细胞与病人T细胞或健康人T细胞共培养，发现LILRB4阳性细胞可抑制T细胞增殖

共培养实验暗示LILRB4表达的肿瘤细胞可抑制T细胞生长，作者做了LILRB4不同的细胞系：LTLRB4 KO组 - 敲掉LILRB4的肿瘤细胞（T）无法再抑制T细胞增殖（E）；LILRB4 KO-WT组 - LILRB4缺陷的肿瘤细胞重新表达LILRB4后又可抑制T细胞增殖；LILRB4 KO-int△组 – 表达LILRB4胞内段缺陷蛋白的肿瘤细胞无法抑制T细胞增殖

继续共培养实验：LILRB4表达肿瘤细胞可影响T细胞周期

共培养实验：敲除LILRB4后的肿瘤细胞无法再抑制T细胞增殖

做完敲除做阻断，LILRB4抗体可解除LILRB4肿瘤细胞对T细胞的抑制作用

LILRB4抗体可增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用（q用PI染色看杀伤；r、t

中肿瘤细胞表达GFP，通过GFP阳性群体占比看杀伤；s看T细胞数目；u看T细胞生成细胞因子的能力）

上面通过肿瘤细胞和T细胞共培养，in vitro的看LILRB4对肿瘤细胞抑制T细胞的贡献，开始in vivo实验：敲除LILRB4的肿瘤细胞成瘤能力弱，抑制T细胞的作用弱

LILRB4抗体可抑制成瘤，解除LILRB4对T细胞的抑制

LILRB4抗体抑制肿瘤延长存活时间的作用不依赖于Fc段（anti-LILRB4-N297A为fc段突变无功能型抗体），依赖与CD8 T细胞（anti CD8敲除T细胞后LILRB4抗体无法再抑制肿瘤生长延长存活时间）

将病人肿瘤直接抑制到小鼠上，发现LILRB4抗体可抑制肿瘤的发展。到这里，作者发现LILRB4信号可抑制T细胞发挥促瘤作用

Dox诱导敲除LILRB4后，肿瘤细胞（表达了GFP）对肝脏、骨髓的浸润降低

LILRB4抗体亦可降低肿瘤细胞对骨髓、肝、脑的浸润

敲除CD8后，LILRB4抗体抑制浸润的作用仍在，暗示抗体阻断浸润的作用不依赖于T细胞，LILRB4参与调节肿瘤细胞的浸润

LILRB4敲除后肿瘤细胞的迁移、归巢能力降低，小鼠存活时间延长、体重减重延缓

敲了看还不过瘾，让一个不表达LILRB4的细胞表达LILRB4后看对迁移、归巢、生存时间、体重的影响，再次暗示LILRB4参与调节肿瘤细胞的浸润，存在促瘤作用，小鼠健康状态负相关

LILRB4促进浸润的作用依赖LILRB4的胞内段

LILRB4抗体可特异性的阻断单核AML细胞（CD45+、CD33+、LILRB4）的浸润。至此，继证明LILRB4可抑制T细胞功能，又证明LILRB4还参与调节肿瘤细胞的浸润

前面证明了LILRB4的功能（抑制T细胞、促进肿瘤细胞浸润），它表达于肿瘤细胞表面，发挥作用依赖胞内信号段，必然存在与其结合的配体，作者设计了一个基于GFP的报告系统以筛选LILRB4的配体：基于已有文献，尝试了一系列配体均无法激活LILRB4，发现小鼠和人的血清可特异性的激活LILRB4

用蛋白纯化分离，之后用GFP报告系统筛选血清中能激活LILRB4的组分，发现APOE可特异性的激活LILRB4

反过来再验证：APOE敲除小鼠的血清无法激活LILRB4

继续验证APOE可与LILRB4结合：APOE与敲除LILRB4细胞的结合能力弱

MST、SPR、Octet技术多方法确证APOE可与LILRB4结合

突变法找APOE上与LILRB4结合的关键位点（还是用GFP报告系统验证）：W106和Y121

结构角度证明了APOE可结合LILRB4，开始功能角度的验证：敲除APOE可达到和敲除LILRB

4相似的效果 – 解除共培养时肿瘤细胞对T细胞的抑制作用

不同的肿瘤细胞（GFP或GFP LILRB4）与T细胞共培养，加入不同的血清（野生型小鼠血清-WT或APOE缺陷型小鼠血清-APOE KO），比较T细胞的比例：加入APOE缺陷小鼠血清组T细胞比例更高，缺陷血清中添加APOE-POPC又可降低T细胞比例，暗示APOE对T细胞抑制作用存在贡献

不同的肿瘤细胞移植到不同的小鼠上，APOE缺陷的受体鼠肿瘤细胞骨髓、肝、脾浸润更低，暗示APOE对肿瘤浸润存在贡献

前面顺藤摸瓜摸到了LILRB4的配体，开始看LILRB4被激活后肿瘤细胞内部的信号变化：参考前人研究，将目光放到了SHP磷酸化上，KO LILRB4后，SHP-2的磷酸化降低，暗示LILRB4通过SHP-2起效

KO 肿瘤细胞SHP-2可解除肿瘤细胞对T细胞的抑制，减少浸润，暗示LILRB4通过SHP-2发挥作用

RNA测序比较野生型和LILRB4缺陷型细胞，由找到了另一个位于LILRB4下游的信号，使用该信号抑制剂BAY11可解除对T细胞的抑制、减少浸润

LILRB4、APOE、SHP-2都是肿瘤细胞上的，LILRB4肿瘤细胞可抑制T细胞，但这个作用必须通过特定物质传递到T细胞，野生型肿瘤细胞产生的条件培养基可抑制T细胞的增殖，看LILRB4缺陷型的肿瘤细胞的条件培养基无明显抑制作用

找肿瘤细胞条件培养基中发挥T细胞抑制作用的的组分，比对发现两种条件培养基中又一系列蛋白含量存在差异

敲掉肿瘤细胞LILRB4后，uPAR在肿瘤细胞表面的表达降低

LILRB4缺陷肿瘤细胞和T细胞共培养体系中加入uPAR可抑制T细胞的生长，暗示uPAR在LILRB4抑制信号下游，即便没有LILRB4扔可抑制T细胞增殖

向T细胞培养体系中添加uPAR并不会抑制T细胞增殖，说明uPAR需作用在肿瘤细胞之后才可发挥抑制作用

LILRB4敲除后，uPAR表达会下调，同时ARG-1也会下调，且活性降低

ARG-1可不依赖APOE、LILRB4、SHP-2发挥抑制T细胞增殖、促进肿瘤细胞浸润的作用 – 终于找到了LILRB4信号的“效应分子”

做了这么多工作就是这么一张图：肿瘤细胞上APOE激活LILRB4后SHP-2磷酸化，NFkB信号激活，uPAR表达升高，ARG-1升高，最终抑制T细胞、促进肿瘤细胞浸润

流式是个很好的技术 – 把LILRB4信号关键节点一次都给测了！

文章始于数据库检索分析，根源是对大数据的把握！找到信息点后按照分子生物学的思路顺藤摸瓜，滤清了一条免疫抑制信号 – 生命体的一切行为都有其分子基础，这就是规律，就是套路……

Mi Deng, Xun Gui, Jaehyup Kim, Li Xie, Weina Chen et al. LILRB4 signalling in leukaemia cells mediates T cell suppression and tumour infiltration.[J] .Nature, 2018.

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