【CNS前沿文献追踪】 – 用iPSC做CAR-NK

CAR-T细胞疗法已广为人知，效果喜人！但CAR-T细胞的制备依赖于患者自体T细胞，无法做到“现货”供应，NK细胞具有MHC非限制性的杀瘤功能，此次整理分享的内容是将CAR（嵌合抗原受体）安装到NK细胞上以增强NK细胞的抗肿瘤作用，具体如下：

作者先筛CAR：识别抗原mesothelin的scFv段结合不同的跨膜、胞内段做成不同的CAR表达于NK92细胞系，不同的CAR在NK92上表达水平相当

所用到的肿瘤细胞系mesothelin表达水平：有高有低，以便比对特异性

不同的CAR-NK92体外裂解肿瘤细胞的能力不同

不同的CAR-NK92 体外肿瘤刺激后脱粒marker CD107a表达水平不同

所筛选的CAR有的是NK细胞专属CAR（根据NK细胞信号传导结构基础设计的，如NKG2D是源于NK细胞表面NKG2D受体），有的直接用的T细胞的CAR，选取NK专属CAR4和源于T细胞的T-CAR（差异主要在跨膜段和共刺激段），比较两种CAR“装在”NK细胞上之后功能的差异：T- CAR在NK92上表达水平相对高一点

尽管T-CAR在NK92上表达水平稍高，但NK专属的CAR4表达于NK92之后得到的CAR-NK抗肿瘤作用更强：特异性裂解靶细胞、脱粒

表达于细胞表面的CAR起的作用是感知外界，将信号传递到细胞内部，让细胞产生相应的变化，看CAR激活后信号的传递情况：专属CAR4比T-CAR更能灵敏的感知肿瘤抗原、传递信号

从NK专属CAR中筛选出了CAR4，也确定专属的CAR4优于T-CAR，开始进一步的“构效”研究：将参与信号传递的跨膜段、共刺激段、胞内信号段进行点突变，看点突变对于CAR-NK功能的影响，首先点突变并不显著影响CAR的表达水平

裂解靶细胞角度：跨膜段NKG2D、共刺激段2B4点突变后CAR-NK裂解靶细胞的能力明显降低，暗示这两部分对于细胞功能贡献大

效应分子角度：跨膜段NKG2D、共刺激段2B4点突变后CAR-NK接受抗原刺激后脱粒、分泌干扰素的能力降低，再次暗示跨膜段、共刺激段两部分对于细胞功能贡献大

CAR激活后信号通路角度的数据也说明跨膜段、共刺激段对于抗原诱导NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力很关键

前面用易得的NK细胞系NK92进行了筛选研究，确定了NK专属的CAR4不错，但NK92细胞系存活、增殖方面存在不足，文章作者设计使用诱导多能干细胞作为“原料”生产NK细胞

iPSC诱导产生的NK和外周血NK细胞表型一致，表达不同的CAR之后表型并不受影响

验证以iPSC为原料生产的CAR-NK的作用：特异性的、高效的对肿瘤抗原产生反应，裂解靶细胞、脱粒

验证以iPSC为原料生产的CAR-NK的作用：肿瘤抗原刺激后CAR-iPSNK特异性的高效激活相关信号通路

In vitro比对CAR-NK和CAR-T：CAR-NK在体外表现出了优于CAR-T的裂解肿瘤细胞的能力

In vivo：NK专属的CAR4较T-CAR能加能够增强CAR-NK的抗肿瘤作用，延长小鼠存活时间

看in vivo的peresistence

对比CAR-T和CAR-NK：CAR-NK起效更快，抑瘤作用更强

CAR-NK较CAR-T更能延长荷瘤小鼠存活时间

CAR-T会引起小鼠体重下降，进一步分析脏器发现：CAR-T会造成脾肿大，淋巴细胞浸润到各个脏器，CAR-NK则不会，暗示CAR-NK毒性更低

分析细胞因子：CAR-T治疗组小鼠血中细胞因子浓度在注射后20天依然维持高水平，而CAR-NK则不会，暗示CAR-NK细胞因子风暴风险较低

一切其实都是联系的，之前分享过把肠道微生物和肿瘤免疫联系到一起的science，这篇是将干细胞和肿瘤免疫联系到了一起，更进一步又把CAR-T模式移植到了NK细胞上！这移植不是简单的移植，而是充分考量NK细胞的特性，由NK细胞的NKG2D受体等演化出跨膜段和共刺激段！世上本没有路，走的人多了才有的路，但是，那路是别人的路，走别人的路容易迷路……

Ye Li, David L. Hermanson, Branden S. Moriarity, Dan S. Kaufman. Human iPSC-Derived Natural Killer Cells Engineered with Chimeric Antigen Receptors Enhance Antitumor Activity [J]. Cell Stem Cell, 2018.

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