【应用笔记】- 宿主细胞蛋白（HCP）的检测与抗体覆盖率的测定

【Webinar预告】

       针对HCP这个热点问题，GE生命科学非常荣幸地邀请到位于美国新泽西Kenilworth的默克公司（在中国称为“默沙东”）的Fengqiang Wang（王凤强）博士，来共同探讨使用ELISA检测残留宿主蛋白所面临的挑战，以及使用何种方法才能获得更好的ELISA抗体覆盖率方面的问题。

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【什么是宿主细胞蛋白？】

       生物药物（或生物制剂）一般通过微生物，植物或动物细胞等生命系统生产。有些细胞系，例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，也可以被作为细胞工厂，让其除了制造自己的生物分子外，还可以生产其他生物制剂。

       宿主细胞蛋白（HCP）就是这些细胞工厂的有效生物副产物。 它们是收获的细胞培养液（HCCF）中的主要杂质之一，并且更容易在细胞死亡或受损时释放，而并不是通过活性分泌释放。 HCP可影响药物的功效和毒性，如果在制造过程中没有除去，则具有长期免疫原性。

       实际上，包括美国和欧盟在内的全球药典都包含用于检测HCP和纯化生物药物的监管指南。今天，就让我们仔细看看和分析科学家是如何来测量宿主细胞蛋白（HCP），以及使酶联免疫吸附测定（ELISA）成为黄金标准的原因。

【HCPs与工艺开发】

       任何新生物制剂的工艺开发的都必须经过检测HCP的特定组合并确认已在纯化过程中将它们降低到安全水平，通常控制在每毫克药物残留纳克级HCPs的范围内【1】。

       正如您知道的那样，有许多因素会影响HCP的检测。首先，由于每个宿主细胞系都具有其自身独特的表达蛋白质特征。其次，即使在同一细胞系中，上游培养条件的任何差异包括温度，酸度，营养供应等，都会影响HCP组合和丰度的准确性，这也就导致您在上游进行的任何更改都可能对HCP产生下游影响。

      因此，作为工艺开发的一部分，您可能需要在各个点调整和优化下游纯化步骤，例如，在蛋白A亲和层析和离子交换层析之后（图1）。

      为了减少HCP，一个可靠且准确的分析方法对于检查和调整每个纯化步骤至关重要： 这个答案就是夹心ELISA。其测定的灵敏度和选择性使其非常适合检测HCP群体的复杂混合物，而且易于操作和自动化，并且可以高通量进行。

图1，ELISA 在每一步生物制药工艺开发阶段都是不可或缺的

【ELISAs如何用于测量生物制剂生产中的HCP？】

       HCP分析中的任何测定有3种类型：检测，定量和鉴定（USP 1132）。 ELISAs使检测和定量变得简单，而如质谱这种正交分析可以在需要时进行鉴定使用。

      ELISA的原理是抗体对其靶抗原的亲和力和选择性，在这种情况下抗体即是HCPs。检测HCP的存在和丰度遵循夹心ELISA方案（图2），通常每次测定均使用单一抗体。但是，鉴于HCP不仅仅是一个个体，而是多种复杂的群体，在一次多分析物检测中，您可能需要多种多克隆抗体来对抗复杂的HCP抗原群体。过程通常包括：

     1，用模拟或空表达盒培养空载细胞系。

     2，用HCP免疫合适的动物宿主，例如兔，山羊或鸡。

     3，提取宿主产生的抗体，通过2D凝胶电泳/ Western印迹检查抗原的覆 盖率。

     4，生物制药公司也可能会使用商业上可用的通用试剂盒进行这些检测，和/或开发流程或平台特定的方法（USP 1132和Ph.Eur。2.06.34），具体取决于需求，开发阶段和成本。

图2，一个典型针对HCP的夹心ELISA实验

【覆盖率不全面怎么办？】

       尽管是基准测定，但ELISAs无法检测到所有内含物。即使采用特定工艺方法，您也不可能使用增加的抗体100％覆盖所有HCP。一些HCP不具有足够的免疫原性以在动物宿主中引发反应，或者仅引发低反应。任何对抗原具有低亲和力的抗体都可能无法用ELISA检测到！

      因此，为了确保使用ELISA对进行HCP定量的准确性，监管机构要求对每个实验进行验证。在许多方案中都会使用到跑2D凝胶电泳/蛋白质印迹并将抗HCP抗体检测与凝胶内总蛋白质染色进行比较。

这种类型的覆盖分析使您能够预估百分比覆盖率，并可以指导您使用更具体的ELISA或正交分析，如质谱分析来填补这一空白。

      2016年和2017年美国和欧盟药典的更新显示了检查覆盖面越来越重要（USP 1132和Ph.Eur.2.06.34）。关于同一主题的日本药典也正在准备中。

     虽然这些更新只是指南和最适宜实践，但大多数分析科学家现在认为覆盖率测定是产品开发的重要组成部分。

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参考文献

【1】The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnol Bioeng. 2015 Sep;112(9):1727-37. doi: 10.1002/bit.25628. Epub 2015 Jul 14.