【CNS前沿文献追踪】 – 分泌PD-1“抗体”的CART

减少“on target，off tumor”是CART改造的一种策略，另一种策略是提高CART抵抗实体瘤免疫抑制微环境的能力。针对“微环境”改善策略，之前整理分享过关于逆转TGF-β免疫抑制作用的CART相关文章，此次整理分享的是能够抵抗免疫检查点的CART，具体内容如下：

设计思路：让T细胞表达识别肿瘤抗原的CAR的同时，让T细胞再额外表达PD-1抗体的scFv段，通过PD-1 scFv段阻断免疫细胞PD-1和肿瘤细胞PD-L1的互作，解除免疫抑制作用！相较PD-1单抗疗法给药后抗体全身分布，这种PD-1 CART可实现对肿瘤的精确打击，只在肿瘤部位分泌“PD-1”，避免在其他部位产生毒副作用

CAR的表达情况及PD-1 scFv的分泌情况：传统CAR（19m28mZ、4H11m28mZ）培养上清中不会检出c-myc标签（PD-1 scFv上带了c-myc标签），PD-1 CAR（19m28mZ/RMP1-14、4H11m28mZ/RMP1-14）培养上清中可检出PD-1 scFv，说明成功制备了PD-1 CART及对照组

选了EL4（淋巴瘤）和ID8（卵巢瘤）两种肿瘤细胞，两种肿瘤细胞IFN-γ刺激后PD-L1表达上调

所制备的CART能特异的对肿瘤细胞产生反应：分泌细胞因子、杀伤肿瘤细胞

验证scFv的功能：19m28mZ/RMP1-14组可分泌PD-1 scFv，分泌出的scFv可结合到CART细胞本身，竞争性抑制PD-1检测抗体的结合，降低PD-1+细胞的检出率

验证scFv的功能：分泌出的scFv除可以结合到分泌细胞本身外，还可以结合到“旁观者”

In vivo验证PD-1 scFv的分泌：小鼠种腹水瘤，40天后灌注CART，48小时后检测腹水中scFv段，可见引入了scFv的CART细胞组均能检测出c-myc标签，说明PD-1 CART细胞在体内可正常分泌PD-1 scFv

PD-1 CART相较传统CART可显著延长腹水瘤小鼠存活时间

PD-1的引入可增强CART的persistence：存活大于120天的小鼠骨髓内仍可通过PCR检出CAR

还是看persistence：PD-1 CART更能耐受二次种瘤

PD-1 CART活性为啥那么好，原来除了CART细胞自身受益于PD-1 scFv外，内源T细胞也受益了 - PD-1 CART组内源T细胞激活、细胞因子水平较传统CART组高

前面做的是小鼠的PD-1，开始筛人的：比较三种抗体对PD-1的结合能力（a），根据3种抗体设计scFv段，比较不同的scFv段在血液中的稳定性（b，c），选取E27进一步研究

设计新的CAR：CAR的表达情况及PD-1 scFv分泌情况

In vitro验证CART的功能：PD-1 CART分泌的scFv可结合到PD-1+的细胞上（g，h），所有CART均可特异的裂解表达对应抗原的肿瘤细胞（i）

相较传统CART组（1928z），PD-1 CART（1928z-E27）杀伤肿瘤细胞的能力更强

相较传统CART组（1928z），和肿瘤细胞共培养后，PD-1 CART（1928z-E27）增殖能力更强

PD-1 CART（1928z-E27）分泌的PD-1 scFv可结合自身的PD-1，竞争性抑制检测抗体的结合，“降低”PD-1水平

不同的CART和T细胞共培养后检测scFv：PD-1 CART（1928z-E27）分泌的PD-1 scFv除可结合自身外（自分泌），还可结合到CAR-的T细胞上（旁分泌）

PD-1 CART细胞和PD-L1+的肿瘤细胞共培养后扩增能力显著增强

PD-1 CART显著延长血液瘤小鼠的存活时间

PD-1 CART显著延长实体瘤小鼠的存活时间，且作用优于CART和PD-1抗体联用

PD-1 CART旁分泌scFv作用可增强传统CART作用，延长小鼠存活时间：SKOV3-PDL1肿瘤只能被4H1128z CART识别，1928z-E27 CART无法识别这个肿瘤细胞，但它分泌PD-1 scFv支援4H1128z CART细胞

前面的数据说明scFv的引入可增强CART的作用，初步说明PD-1 CART由于CART和anti-PD1联用，PD-1 CART的另一优势在于CART可识别肿瘤部位，讲PD-1阻断只限定在肿瘤位置，避免全身扩散，引起不必要的毒副作用：小动物活体成像显示PD-1 CART分泌的scFv只局限于肿瘤部位，而注射的PD-1抗体全身分布

检测血清中的抗体或scFv段后也显示PD-1 CART分泌的scFv段具有肿瘤靶向性，血清中含量很低，而PD-1抗体在血清中浓度较高

文章作者管这种CART叫armored CART，分泌的PD-1 scFv在给自己穿上抵御肿瘤细胞PD-L1攻击的盔甲的同时还能给内源T细胞也穿上盔甲，不同于PD-1抗体的全身弥散，PD-1 CART只在肿瘤部位起效，闹的动静并没那么大，因此毒副作用更小。不同的设计思想来源于设计者信息背景的不同以及信息处理模式的不同，信息的交汇、精炼产生知识，能旁观这个过程很幸福......

Rafiq Sarwish,Yeku Oladapo O,Jackson Hollie J et al. Targeted delivery of a PD-1-blocking scFv by CAR-T cells enhances anti-tumor efficacy in vivo.[J] .Nat. Biotechnol., 2018.

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