【应用笔记】药筛利器-HTRF®检测技术

HTRF®技术简介

相时间分辨荧光技术（HTRF®）是一种用来检测纯液相体系中待测物的方法。HTRF®结合了荧光共振能量转移（FRET）和时间分辨荧光（TRF）两种技术，将FRET的均相实验方式和TRF的低背景特性融合在一起，提供了更高的灵敏度和稳定性。

图1.HTRF®技术原理示意图

HTRF®技术具有以下特点：

a) 易于实现微型化

b) 低背景，化合物和培养基的影响小

c) 均相检测，操作简单，无需洗板

d) 实验稳定，对酸性溶液、金属离子、EDTA等耐受；

e)读数稳定24 h以上，甚至可达7天

HTRF®应用说明

HTRF®技术为现代药物研发提供多种服务，包括在生化水平或细胞水平上的小分子或者生物治疗药物的研发。下面举例的HTRF®应用，均采用BioTek多功能酶标仪检测。

GPCR配体结合研究

采用Cisbio的Tag-lite®技术研究GPCR配体与趋化因子受体CXCR4的结合实验。图2显示的是Synergy^TMH1检测D2标记的CXCR4激动剂SDF1-α与Lumi4®-Tb标记的CXCR4结合以及Kd测定。还可以进行抑制剂相关研究，图3表示未标记的SDF1-α和小分子AMD3100与标记配体竞争结合实验的结果。

图2. 用Synergy^TMH1测定d2-SDF1-α Kd常数。测得Kd=19.6 nM（Cisbio参考值18.7 nM）

图3. 竞争性实验检测。AMD3100和SDF1-α的IC50分别是29.4 nM和29 nM

GPCR小分子化合物高通量筛选

GPCR是以小分子化合物为基础的治疗靶点，市面上约50%的药物都直接作用于这一靶点。结合BioTek酶标仪和Tag-lite®技术，可高通量筛选小分子化合物，图4为筛选的柱状图结果。

图4. 在天然产物化合物库筛选结果中，抑制效应分布比例图

       BioTek酶标仪还可以用于二级筛选，通过检测出完整的化合物计量效应曲线，进而测定初筛中的化合物活效。图5是初筛中的三个阳性对照Exendin-3、Exendin-4、GLP-1的二次筛选结果。

图5. 阳性抑制化合物的剂量效应曲线

细胞水平的蛋白激酶实验

HTRF®细胞内激酶实验可以检测信号转导通路中特异位点的磷酸化水平，原理见图6。该方法具有很好的灵敏度，可以取代传统的检测技术如WesternBlot和ELISA。

图6. HTRF®细胞水平激酶检测原理：实验分为三步，信号通路激活，使得激酶底物被磷酸化；裂解细胞膜并释放被磷酸化的底物至溶液中；加入三明治免疫分析试剂后检测

       检测人上皮肿瘤细胞系A431中STAT3（Tyr705）磷酸化水平，结果如图7、图8所示。

图7. A．EGF对STAT3（TYyr705）磷酸化的激活效应表现为完整的剂量效应作用   

B．分别从40个EGF浓度为600 nM和0 nM重复数据中计算出Z’值

图8. 小分子抑制剂，SD1008，Stattic和cryptotanshinone对

EGF诱导STAT3（Tyr705）磷酸化水平的抑制曲线

生物治疗药物研发

研发抗体药物，需要针对特定靶点（如RTK和GPCR）筛选出有效的单克隆抗体，并且一些单克隆抗体还能激活效应细胞的免疫系统，引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）过程。

RTK结合实验

SNAP-tag®克隆构建可以在细胞水平上间接检测cetuximab与受体酪氨酸激酶（RTK）EGFR之间的结合能力。RTK上标记Luma4®－Tb作为荧光供体，与 Cetuxima结合后，加入D2标记anti-hFc抗体，可以产生HTRF®信号（图9）。

图9. 酪氨酸激酶受体EGFR上标记Lumi4®－Tb。通过D2标记的种属特异的Fc抗体可以检测抗体与目标抗原之间的结合。当目标抗体特异性结合Lumi4®-Tb标记的受体抗原，再另外加入荧光标记的二抗，并且能够结合到非标记的抗上，进而引起HTRF®信号增加

       这一检测方法可以测定 cetuximab结合常数，如图10所示。

图10. 采用 Cetuximab剂量效应曲线计算 cetuximab的解离平衡常数Kd

细胞内CD16a结合实验

在这一方法中， FcyRIIIA在细胞中稳定表达，并且γ链通过SNAP®-Tag标记Lum4®-Tb。加入荧光受体D2标记的抗人IgG抗体后，特异性产生HTRF®信号。用未标记的IgG抗体竞争取代标记的IgG抗体，相应的HTRF®的信号逐降低，因此用于评估IgG抗体与 FCYRIIIA以及γ链结合能力（如图11）。

图11. 细胞水平上的竞争结合实验可以用于评估免疫治疗中IgG抗体

与FCYRIIIA的结合能力并确定能否用于ADCC实验检测

           图12中，证实hIgG1与FcyRIIIA有高亲和力，并且 cetuximab可以招募效应细胞和预期一样，鼠源抗体与D2标记的人源IgG抗体无竞争。

图12. 测定治疗抗体与 FcyRIIIA结合能力

HTRF®检测仪器

HTRF®检测需要仪器支持高性能的时间分辨荧光检测模块，如果是高通量筛选的客户，还需要整体的数据管理分析系统，而BioTek可根据用户的筛选通量、检测速度及后续药理表型评估需求的不同提供多种不同的检测设备方案，例如您可以选择Synergy^TMNeo2全球前沿技术的HTS设备进行高通量HTRF®筛选，或者选择灵巧的Hybrid^TM检测系统Synergy^TM H1或Cytation^TM系列等。（长按扫描二维码，获取更多详细介绍）

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