Klenow片段(3´→5´ exo-)是DNA聚合酶I的N末端截短物,它保留了DNA聚合酶活性,但5´-3´ 核酸外切酶活性缺失。该酶进一步经点突变(D355A,E357A)去除了其 3´-5´的核酸外切酶活性。因此该DNA聚合酶无任何外切酶活性,仅包含了DNA聚合酶活性,广泛用于标记探针制备、cDNA 第二条链的合成等建库试验。
*10×Klenow Buffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0 at 25 °C), 50 mM MgCl2, 10 mM DTT. 该酶兼容PCR Buffer和内切酶Buffer。
单位定义
一个活力单位即在37°C条件下,30分钟内催化10 nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。
应用
用随机引物制备探针
随机引物法标记
cDNA 第二条链的合成
该酶不能用于产物平端不齐
储存
-20°C可保存3年。
失活75°C,20min失活。
应用实例1:在以A3824-03或 A3828-03,用 LP1002引物组进行的LAMP测试。Bst4.0 SYBR Green试剂可在标准定量PCR仪或恒温荧光仪上进行反应。以体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies,NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应25min的检测结果,可以看到检测反应<20min(达平台期)。
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应用实例2: 用 LP1002引物组进行的LAMP测试。OG变色法为终点变色策略,在反应结束后,倒置反应管,溶解管盖上染料后,阳性样本呈现出醒目的绿色,阴性表现出橙色,区分明显。且该方法不受样本类型限制,杂质耐受性很好。以体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies,NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应20min后检测结果。
![](https://img1.17img.cn/17img/images/202408/uepic/1ab7e4d0-ee4e-4ac0-a331-5e5047ebd645.jpg)
应用实例3:采用荧光酶活测定法在30℃和60℃条件下测定HotStart Bst 4.2,结果显示与未加入Aptamer的对照比较来看。HotStart Bst 4.2在30℃条件下酶活几乎无活性,而60℃条件下1min内酶活完全释放,恢复100%活性
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