Equi-phi29 DNA Polymerase是phi29的改造体,并经多次纯化分离而得。在保留了phi29 DNA聚合酶的链置换、连续合成特性(>70kb)的基础上,提高了滚环扩增的反应温度,该酶酶可以在42℃条件下持续的进行DNA合成(而phi29 DNA 聚合酶在此温度下反应活性很低)。
这种高温的反应特性,在以下几个方面对实验有明显的提升:(1)在NGS测序中,其提升了高GC含量、回文结构等复杂模板的延伸能力,使得NGS的覆盖度更均一,降低测序所需深度;(2)高温的反应条件,提升了基因组DNA的WGA产物的合成量,并可以进行变温扩增;(3)降低测序中Gap区域,提升单细胞测序的数据质量和完整度;(4)降低非特异性扩增产物;(5)提升MDA/RCA等实验的扩增性能和特异性。
此外,Equi-phi29 DNA Polymerase仍然具有很强的3’-5’外切酶校读功能,合成的DNA片段保真性高。该酶的外切酶活性较强,因此合成过程中引物需要3’端硫代修饰,以降低外切活性对引物的切割效应。
主要特征
超强链置换能力
连续合成能力
扩增的高保真性
应用
DNA恒温滚环扩增
需强链置换和DNA连续合成的反应
质粒快速复制
高保真快速复制
储存
-20℃可保存3年。
应用实例1:在以A3824-03或 A3828-03,用 LP1002引物组进行的LAMP测试。Bst4.0 SYBR Green试剂可在标准定量PCR仪或恒温荧光仪上进行反应。以体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies,NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应25min的检测结果,可以看到检测反应<20min(达平台期)。
![](https://img1.17img.cn/17img/images/202408/uepic/dc60417d-148e-413c-87cc-676bd5a3d7e1.jpg)
应用实例2: 用 LP1002引物组进行的LAMP测试。OG变色法为终点变色策略,在反应结束后,倒置反应管,溶解管盖上染料后,阳性样本呈现出醒目的绿色,阴性表现出橙色,区分明显。且该方法不受样本类型限制,杂质耐受性很好。以体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies,NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应20min后检测结果。
![](https://img1.17img.cn/17img/images/202408/uepic/1ab7e4d0-ee4e-4ac0-a331-5e5047ebd645.jpg)
应用实例3:采用荧光酶活测定法在30℃和60℃条件下测定HotStart Bst 4.2,结果显示与未加入Aptamer的对照比较来看。HotStart Bst 4.2在30℃条件下酶活几乎无活性,而60℃条件下1min内酶活完全释放,恢复100%活性
![](https://img1.17img.cn/17img/images/202408/uepic/8dc01f70-54d3-4033-9cef-16f757dacbab.jpg)
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