NADH 氧化酶(NOX)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060703022028964](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060703022028964.png)
溶液的配制:
试剂六:临用前加入 4.5 mL 双蒸水,用不完的试剂-20℃分装保存。
产品说明:
NOX(EC 1.6.99.3)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,可在氧气存在下,直接将NADH氧化为NAD+。该酶不仅参与NAD+的再生,而且与免疫反应密切相关。
NOX能够将NADH氧化为NAD+,NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝(DCPIP)的还原相偶联,蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP,在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1) 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2) 将匀浆 600g,4℃离心 5min。将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
3) 将上清液转移至另一 EP 管中,即胞浆提取物,用于线粒体中泄露 NOX 活性测定。
4) 沉淀即为线粒体,加入 200μL 试剂二和 2μL 试剂三,反复吹打充分混匀,用于 NOX 活性测定,并用于蛋白浓度测定。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至600nm,蒸馏水调零。
2、 试剂四37℃保温放置。
3、 加样表:
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将上述试剂按顺序在微量玻璃比色皿/96 孔板中操作,加入试剂六后立即混匀,同时开始计时,在 600nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1,迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃水浴中,准确反应 1 分钟。迅速取出比色皿并擦干,记录 1 分 20 秒时的吸光度 A2。计算 ΔA=A1-A2,记录 ΔA 测定、ΔA 对照,ΔA=ΔA 测定-ΔA 对照。96孔板放于就近的恒温箱中,有些酶标仪带有内控温度设置的请设置为 37℃,1 分钟后再次测量即可。
三、NOX 活力单位的计算
A 用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下
按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
NOX(U/mg prot)=ΔA÷0.01×V反总÷(Cpr×V样) ÷T=2500×ΔA÷Cpr
V反总:反应总体积,0.25mL;V样:加入样本体积,0.01mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,1min。
B 用96孔板测定的计算公式如下
按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。
NOX(U/mg prot)=ΔA÷0.005×V反总÷(Cpr×V样) ÷T=5000×ΔA÷Cpr
V反总:反应总体积,0.25mL;V样:加入样本体积,0.01mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL; T:反应时间,1min。
注意事项:
1、粗酶液的提取必须在 0℃- 4℃中操作完成,以防止酶变性失活。
2、比色皿中反应液的温度最好保持 37℃,取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水,将此烧杯放入 37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
4、实验时,试剂六样本在冰上放置,以免变性和失活。
5、因通过反应速率计算酶活,使用 96 孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数量。
6、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活,若用样本质量计算,则需加测胞浆提取物酶活,上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
7、附:使用样本质量计算公式
A、按微量玻璃比色皿计算:
单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
NOX 上清(U/g 质量)=ΔA1÷0.01×V 反总÷(W÷V 提取×V 样)÷T=2525×ΔA1÷W
NOX 沉淀(U/g 质量)=ΔA2÷0.01×V 反总÷(W÷V 样总×V 样)÷T=505×ΔA2÷W
NOX(U/g 质量)= NOX 上清+ NOX 沉淀=2525×ΔA1÷W+505×ΔA2÷W
ΔA1:上清测定值;ΔA2:沉淀测定值;V 反总:反应总体积,0.25mL;V 样:加入样本体积,0.01mL;V
提取:加入试剂一体积,1.01mL;V 样总:沉淀重悬体积,0.202mL;W:样本质量,g;T:反应时间,1min。
B、按 96 孔 UV 板计算:
单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。
NOX(U/g 质量)=ΔA1÷0.005×V 反总÷(W÷V 提取×V 样)÷T=5050×ΔA1÷W
NOX(U/g 质量)=ΔA2÷0.005×V 反总÷(W÷V 样总×V 样)÷T=1010×ΔA2÷W
NOX(U/g 质量)= NOX 上清+ NOX 沉淀=5050×ΔA1÷W+1010×ΔA2÷W
ΔA1:上清测定值;ΔA2:沉淀测定值;V 反总:反应总体积,0.25mL;V 样:加入样本体积,0.01mL;V
提取:加入提取液体积,1.01mL;V 样总:沉淀重悬体积,0.202mL;W:样本质量,g;T:反应时间,1min。
实验实例:
1、 取 0.1g 肺进行样本处理,按照测定步骤操作,用微量玻璃比色皿测得 ΔA1=ΔA 测定-ΔA 对照=(0.8136-0.118)-(0.9216-0.8079)=0.5819,ΔA2=ΔA 测定-ΔA 对照=(0.8546-0.4736)-(0.9539-0.9121)=0.3392,按样本质量计算酶活得:
NOX 上清(U/g 质量)=2525×ΔA1÷W=2525×0.5819÷0.1=14692.975
NOX 沉淀(U/g 质量)=505×ΔA2÷W=505×0.3392÷0.1=1712.96
NOX(U/g 质量)=NOX 上清+NOX 沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
=2525×0.5819÷0.1+505×0.3392÷0.1=16405.935 U/g 质量。
2、 取 0.1g 叶片进行样本处理,按照测定步骤操作,用微量玻璃比色皿测得 ΔA1=ΔA 测定-ΔA 对照=(0.8518-0.7998)-(0.886-0.8831)=0.0491,ΔA2=ΔA 测定-ΔA 对照=(0.872-0.8296)-(0.916-0.9149)=0.0413,按样本质量计算酶活得:
NOX 上清(U/g 质量)=2525×ΔA1÷W=2525×0.0491÷0.1=1239.775
NOX 沉淀(U/g 质量)=505×ΔA2÷W=505×0.0413÷0.1=208.565
NOX(U/g 质量)=NOX 上清+NOX 沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
=2525×0.0491÷0.1+505×0.0413÷0.1=1448.34 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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