冷冻鱼糜

我国海洋领域首个冷冻电镜中心建成，目前已全面对外开放共享，为用户提供样品制备、数据解析等服务。冷冻电镜也称低温电子显微镜，是一种能够对生物样品实现高分辨三维结构解析的高精尖设备。“如果说天文望远镜观测的是极宏观的天体，那么冷冻电镜则是针对极微观的生物大分子，观测水平达到十分之一纳米（百亿分之一米）级别。” 海洋试点国家实验室冷冻电镜中心主任沈庆涛教授说，冷冻电镜技术目前还非常新颖，但已经在生物学领域产生了极大影响，被诺贝尔奖官方称为“使得生物化学进入一个新时代”的技术。自2013年开始，冷冻电镜成为诸多诺奖级论文成果的得力助手。海洋试点国家实验室建设的冷冻电镜中心，是山东省首个冷冻电镜中心，也是我国乃至全球首个聚焦海洋生命科学的冷冻电镜中心。“生命来源于海洋，但目前国内外对陆地生物的研究比海洋生物更全面更系统，冷冻电镜的工作也多集中在陆地模式生物上。” 沈庆涛介绍，针对生命科学回归海洋的趋势，充分发挥海洋试点国家实验室的“向海”特长，他们建立了海洋领域首个冷冻电镜中心，以海洋生物为研究目标，推动海洋生物学从宏观走向微观，从生态、细胞水平走向分子水平。为了保证冷冻电镜的高分辨率解析能力，海洋试点国家实验室同时配备了冷冻电镜中心环境适配系统。“冷冻电镜设施昂贵精密，对于每个样品通常需要花费2-3天拍摄成千上万张照片，提取近百万生物大分子颗粒进行后续的图像处理。” 沈庆涛表示，在此过程中，环境适配系统能够对温度、湿度、磁场、震动等因素进行控制并适配，从而保证冷冻电镜自始至终状态稳定。

冷冻电子显微镜的进展为大分子蛋白质结构测定提供了潜力，但是在多域蛋白质的域间方向建模，成功率仍然很低。近日，Nature子刊，作者使用冷冻电子显微镜开发了自动的域增强建模（DEMO-EM）方法。DEMO-EM方法通过结合刚体域拟合和柔性装配模拟（具有深度神经网络域间距离分布的灵活装配模拟）的渐进式结构精调程序，从冷冻电子显微镜图中组装多域蛋白结构。该方法在包含多达 12 个连续和不连续结构域的大规模蛋白质基准集上进行了测试，这些结构域具有中到低分辨率的密度图，其中，对于 97% 的案例，DEMO-EM 生成的模型具有正确的域间方向（模板建模分数（TM 分数）0.5），并且优于最先进的方法。DEMO-EM流程图使用结核分枝杆菌依赖性因子的三域蛋白进行说明从查询序列开始，域边界首先由FUpred和ThraDom预测，每个域的模型由DI-TASSER生成。同时，使用深度学习卷积网络DomainDist预测域间距离。其次，每个域模型都通过拟牛顿搜索独立地拟合到密度图。第三，初始全长模型通过两步刚体REMC模拟优化，以最小密度图和全长模型之间的DCS。第四，使用由DCS、域间距离分布和基于知识的力场引导的REMC模拟，通过原子级、分段级和域级精调的柔性装配对从刚体装配模拟中选择的最低DCS模型进行精调，得到decopy构象由SPICKER聚类以获得质心模型。最后，对全原子模型再次进行柔性装配模拟，其中质心模型的约束增加了能量，最终模型是用FASPR和FG-MD侧链重新包装后的最低能量模型构建。DEMO-EM是一种基于冷冻电镜图的多域蛋白质结构确定的分层方法，由四个连续步骤组成：（1）确定域边界并对单个域建模（2）将域模型与密度图匹配初始框架生成（3）用于域位置和方向优化的刚体域结构组装（4）全长结构模型的柔性结构组装和细化模拟从冷冻电镜合成密度图构建多结构域蛋白从查询的氨基酸序列开始，首先应用LOMETS[1]从PDB创建多个模版比对，其中ThreaDom用于根据域保守分数预测域边界。如果蛋白质被LOMETS定义为“简单”目标，并且比对覆盖率95%，则应用ThraDom预测的域定义。否则，通过FUpred（通过最大化域内接触的数量[3]和最小化由基于深度学习的神经网络ResPRE[2]）预测的接触图上的域间接触的数量来预测域边界。接下来使用DI-TASSER[4]生成每个域的结构模型，它是I-TASSER[5]的一个版本，通过将深度学习预测的残基间接触和距离图以及氢键电位结合到迭代搜索全基因组和宏基因组序列数据库来构建多序列比对（MSA）。然后根据TripletRes预测的接触选择最前面的MSA，将其输入到ResPRE[2]，TripletRes是基于深度残基神经网络预测距离图、氢键网络和扭转角。这些预测的约束被集成到I-TASSER力场中以指导replica-exchange 蒙特卡洛模拟（REMC）。最终模型由SPICKER聚类并由FG-MD改进。对于包含来自查询序列不同区域的两个或多个片段的不连续域，域模型是通过顺序连接所有片段的序列获得的。基于深度神经网络的域间距离预测为了帮助指导域方向组装，域间距离图由深度残差神经网络算法DomainDist预测，DomainDist 是TripletRes 的扩展，最初开发它是为了基于共进化矩阵的三元组预测残基间接触图，但在这里扩展以预测 2-20 Å 范围内 36 个 bin 内残基间距离的概率。DomainDist 程序在从 PDB 收集的 26,151 种蛋白质的非冗余数据集上进行训练，其中每种蛋白质的 MSA 是使用 HHblits搜索 Unilust30 序列数据库构建的. 除了 TripletRes 中采用的二维 (2D) 协同进化特征外，还采用了三个一维 (1D) 特征，包括隐马尔可夫模型、Potts 模型的序列和场参数的 one-hot 表示并平铺到两个维度并与二维协同进化特征连接。神经网络结构是按照卷积策略设计的，使用 ResNet 基础模块。神经网络模型由 Adam 优化算法训练，以最小化交叉熵损失。尽管 DEMO-EM 只考虑了域间距离信息，但在训练过程中同时考虑了域内和域间距离信息。基于拟牛顿的域匹配和冷冻电子密度图对于来自 DI-TASSER 的每个单独的域模型，我们使用有限内存Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno (L-BFGS)，一种具有六维 (6D) 平移-旋转自由度的准牛顿优化算法，来识别与密度图相关性最高的域的最佳位置和方向。由于L-BFGS是一种局部优化方法，其结果取决于初始解，因此作者通过枚举欧拉角的所有组合( φ, θ and ψ )，以步长Srot_ang穿过密度图空间。对于domain pose，密度相关分数（density correlation score，DCS）用于指导L-BFGS模拟。Nvol是voxels的个数（网格点），ρEM (vi ) 是第i个voxel的实验密度。decopy结构探针密度定义为：刚体域组装执行两轮刚体域组装模拟以优化域位置和方向。在第一轮中，这些域被视为粒子，并进行快速的REMC模拟，以根据全局模拟密度相关性调整各个域的位置。第二轮刚体REMC模拟用于微调域位姿，其具有更详细的能量立场。原子级灵活的域组装和细化灵活的域组装和细化过程包含两个阶段的模拟，具有渐进的voxels分辨率和采样焦点。在第一阶段，实施了6种不同的动作，（1）LMProt 扰动，（2）围绕连接两个末端的轴的片段旋转，（3）片段沿序列的构象移位，（5）刚体段平移，（5）刚体尾部旋转和（6）刚体域级平移和旋转。第二阶段，使用在所有原子上计算的DCS实现Voxel大小为2 Å 的更精细的密度图。此外，所有残基都有相同的概率被选中进行移动和采样。当交换次数达到 100 时，模拟终止。选择最低能量的诱饵来构建最终模型，侧链原子由 FASPR 重新包装，然后是 FG-MD 细化。结果表2显示了从同一组预测域模型开始时从 MDFF 和 Rosetta 获得的结果，其中初始构象由 Situs 和 MAINMAST 建模组装。这些数据再次表明，DEMO-EM 的表现优于 MDFF、Rosetta 和 MAINMAST，全长模型的平均 TM 分数分别比 MDFF、Rosetta 和 MAINMST 高 60.0%、87.2% 和 144.4%。最后，作者在所有 51 个案例上将 DEMO-EM 与最先进的端到端深度学习结构预测方法 AlphaFold2 进行了比较。由上表所示, 虽然 AlphaFold2 预测的单个域的 TM-score (0.89) 比 DEMO-EM (0.84) 高，这可能是因为 DI-TASSER 构建的域模型质量较低，整体质量DEMO-EM 构建的全长模型（TM-score 为 0.88）优于 AlphaFold2（TM-score 为 0.84），DEMO-EM 在 28 出时获得了比 AlphaFold2 更高的 TM-score 51 种蛋白质。作者还将 AlphaFold2 构建的相同全长模型输入 MDFF、Rosetta 和 DEMO-EM，以检查灵活组装和细化过程的性能。所有方法都改进了初始全长模型，即使对于最佳预测模型，也显示了冷冻电镜数据的有用性。源代码：https://zhanggroup.org/DEMO-EM/参考资料[1] Zheng, W. et al. LOMETS2: improved meta-threading server for fold-recognition and structure-based function annotation for distant-homology proteins. Nucleic Acids Res. 47, W429–W436 (2019)[2]Li, Y., Hu, J., Zhang, C., Yu, D.-J. & Zhang, Y. ResPRE: high-accuracy protein contact prediction by coupling precision matrix with deep residual neural networks. Bioinformatics 35, 4647–4655 (2019)[3] Zheng, W. et al. FUpred: detecting protein domains through deep-learning based contact map prediction. Bioinformatics 36, 3749–3757 (2020)[4] Zheng, W. et al. Protein structure prediction using deep learning distance and hydrogen‐bonding restraints in CASP14. Proteins 89, 1734–1751 (2021)[5]Yang, J. et al. The I-TASSER suite: protein structure and function prediction. Nat. Methods 12, 7–8 (2015).

揭示生物学样本和材料样本原本无法观察到的内部结构冷冻断裂是一种将冰冻样本劈裂以露出其内部结构的技术。冷冻蚀刻是指让样本表面的冰在真空中升华，以便露出原本无法观察到的断裂面细节。金属/碳复合镀膜能够实现样本在SEM（块面）或TEM（复型）中的成像，主要用于研究如细胞器、细胞膜，细胞层和乳胶。这项技术传统上用于生物学应用，但现在逐渐在物理学和材料科学中展现出重要意义。近年来，研究人员通过冷冻断裂电子显微镜，尤其是冷冻复型免疫标记（FRIL），对膜蛋白在动态细胞过程中所发挥的作用有了新的见解。作者：Gisela Höflinger图1：麦叶上的蚜虫适合于电子显微镜的环境电子显微镜的样品室通过抽真空处理降至极低压力。置于这种环境下的活细胞无法有效保全结构，因为细胞构成中的大部分水分会快速蒸发。生物样本的制备方法有很多种。样品材料被（固定）保存，这样后续脱水对原位结构的破坏最小，同时可以使用环境扫描电镜（SEM）或者将水冷冻。高压冷冻是观察自然状态下含水结构的唯一方法。高压冷冻所形成的冰不是六边形冰（从水变为六边形冰时体积会增加）而是无定形冰，因此体积保持不变。所以，对渗透和温度变化敏感的结构得以保留（见文章“高压冷冻基础介绍”）。要观察诸如细胞器、细胞膜、乳胶或液体的表面界面等结构，冷冻断裂是唯一的方法。通过刀片（或类似物）或释放弹簧负载的外力来破开冷冻样本，并沿着最小阻力线断裂样本。图2：冷冻断裂（来源：http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Lipids/Membrane_Fluidity） 水的升华与凝结 – 冷冻蚀刻与污染要暴露冷冻断裂面，需要把冰去除。这就需要通过把断裂面的冰升华去除以保存样品的结构。升华的过程是冰不经过液态过程直接转化为气态。而液态过程会导致样品体积和结构的破坏。图3：ES，细胞外表面；PF，细胞膜冷冻断裂面；EF，细胞膜外层冷冻断裂面；FS，细胞膜内表面；Cyt，细胞质水的升华/冷凝过程取决于特定温度下的饱和压力，以及水或冰在室内的有效水分压。注意：良好的真空度会降低水分压。例如：温度为-120℃的冰或冰冻样本饱和压力约为10-7 mbar。如果样品室内达到这个压力，则冷凝和蒸发处于平衡状态。蒸发的分子数量等于冷凝的分子数量。在更高压力下，冷凝速度要快于升华速度 – 因此冰晶会在样本表面上生长。必须采取一切手段来避免这种情况。样本上方一个较冷（比样本更冷）的冷阱会降低局部压力，从而起到了冷凝阱的作用。从样本中带出的水分子优先附着在较冷的表面上。在低于饱和压力的压力下，更多的分子升华而不是冷凝，同时会发生冷冻蚀刻。执行冷冻蚀刻直到样本完全无冰，这一过程称为冷冻干燥。仅适用于合理时间内执行的小样本。该过程分为几个步骤，需要从大约-120℃加热到-60℃，同时在每个步骤上使温度保持一定时间。该过程需要几天的时间来完成。图4：饱和蒸汽压力（感谢Umrath 1982提供的图片）样本温度低于-120℃时，蚀刻速度非常慢，蚀刻持续时间会增加到不切实际的程度。如果真空室的压力固定，则可以通过提高样本温度来提高蚀刻速度。对于生物样本，要特别小心温度高于-90℃。蚀刻速度会大幅提高。另外，要注意玻璃态冰中形成六边形冰晶从而导致脱水伪像。纯水的理论升华速度会降低，因为：• 样本深处的水升华速度比表面的水更慢。• 盐和大分子溶剂会降低升华速度。• 生物样本中大量存在的结合水会降低升华速度。通过冷冻断裂生成图像冷冻断裂和冷冻蚀刻技术往往采用高真空精细镀膜技术，将超细腻重金属和碳薄膜沉积于断裂表面。冷冻断裂样本在一定角度下用金属覆盖，然后在碳背衬膜（徕卡EM ACE600冷冻断裂或徕卡EM ACE900与徕卡EM VCT500）上生成复型进行TEM成像或在SEM的试块面上进行成像。对于这两种方法，冷冻断裂表面经过一定的蚀刻时间后以相同的方式进行镀膜。首先在一定角度下进行一层薄的（2-7nm）重金属镀膜，以形成地形对比度（阴影）。其次再针对重金属薄膜，在90°下进行一层厚的碳层（15-20nm）镀膜，以稳定超薄电子束蒸发。此时的蚀刻处理会停止。要对极小的结构进行成像，需要在极低的角度（2–8°）镀膜重金属并在镀膜期间旋转样本。这样可增加细丝状及其它细小结构的对比度。此项技术又称为小角度旋转投影。蒸镀重金属薄膜需要采用电子束蒸发镀膜技术。这种镀膜技术可实现精细定向沉积。碳的支撑层稳定了未被金属覆盖的结构。随着温度的升高，这些结构会改变它们的轮廓，样本不会完全导电，复型也不会粘在一起。冷冻断裂酵母的单向投影图5：低温SEM，BSE（背散射电子）图像。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。图6：复型，TEM图像（感谢Electronmicroscopy ETH Zürich提供图片）。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。图7：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。油/水基样品，–100℃（升华）3分钟暴露油脂结构。图8：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。原生生物游仆虫混合培养的羽纹硅藻。感谢英国波特斯巴NIBSC的Roland Fleck博士提供图片图9：徕卡冷冻断裂系统及徕卡真空冷冻传输至低温SEM的HPF、冷冻断裂、冷冻蚀刻和低温镀膜。油/水基乳液破裂，露出洋葱状薄片结构，形成液滴。感谢汉堡拜尔斯多夫Stefan Wiesner博士提供的图片。图10：TEM中的酵母细胞复型。经徕卡高压冷冻和徕卡冷冻断裂复型制备。感谢Elektronenmikroskopie ETH Zürich提供的图片。图11：大麦叶上的真菌。安装于徕卡冷冻断裂仪样本台上，并通过冷却样本台在液氮下进行冷冻。徕卡冷冻断裂仪对样品进行部分冷冻干燥（在更高的样本温度下冷冻干燥）。使用钨镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温FESEM 5keV。相关产品徕卡EM ACE900 高端EM样本制备冷冻断裂系统徕卡EM VCT500了解更多：徕卡官网