冷冻液

在适当的时候结束初级和次级干燥步骤是提高冷冻干燥过程效率的一个关键方面。使用压力作为终点判定标准是确定这两个冻干步骤终点的一个很好的方法。下文中会描述原理和相关的工具来进行压差测量。文中的实验数据对建立最合适的终点标准时会起到作用。上周末我和一群朋友去山里徒步旅行。我们走了几个小时，午饭时间到了一间小屋。此时，我们已经完全没有体力活动和呼吸新鲜的空气了。我们坐下来，点了很多好吃的东西，然后开始把自己弄得傻乎乎的。当我发现肚子里有压力和疼痛时，我才停下来。我的胃不舒服地扩大了我徒步旅行短裤的腰围，并成为这个午餐时间暴食的一个明显的终点标准。当我坐在那里，试图消化和准备继续前行时，我陷入了沉思。老实说，每当我陷入思考的时候，我通常都在想着实验室。当我感觉到胃里的压力逐渐减轻时，我回想起的不仅是一顿丰盛的饭菜，还意识到压力对于判定终点非常有帮助。我在之前已经讨论了冷冻干燥后使用温度来确定次级干燥步骤的终点。在这里，我想给您介绍一个基于压力差的替代方法。冷冻干燥事实上，压力差测试是一种非常好的无损终点检测方法，用于确定初级或次级干燥阶段的结束。该技术使用两种不同的压力计，一个皮拉尼传感器和一个电容压力计。皮拉尼传感器的工作原理是气体的热导率随压力变化。压力计用一根细导线悬挂在气体中，用电流加热来测量压力。在高压下，由于周围气体分子与金属丝的高碰撞率，金属丝将热能损失给气体。这一原理如下图所示。当真空降低时，气体分子的数量和周围介质的导电性一起减少。然后，媒介开始慢慢失去热量。由于这一过程依赖于气体分子的热导率和气体成分，皮拉尼传感器只能在其校准条件下显示正确的压力，而校准条件通常设置在纯氮或空气环境中。除了皮拉尼传感器外，电容式压力计还用于独立于气体成分测量压力。对于这种类型的压力计，电容信号的差异是由压力计内部的物理变化产生的，而不是气体性质的变化。因此，用电容式压力计测量压力与气体成分无关。如果您像我一样，您可能会想知道这两种工具在这种终点确定中是如何协同工作的。在冷冻干燥过程中，由于冰的升华，干燥室内的气体几乎完全由水蒸气组成。样品干得越多，气体成分的变化就越大。水蒸气被氮气或空气代替，直到干燥过程结束时，室内气体只含有纯氮气或空气。由于水蒸气的热导率比氮气的热导率高约 1.6 倍，皮拉尼压力计在纯水环境中的测量偏差约为 60%。皮拉尼压力计和电容式压力计只能在样品干燥后测量相似的压力，并且室内气体的成分主要是纯氮或空气。因此，当到达终点时，两个工具显示的压力相同。下图以图形方式描述了该过程。重要的是，压力波动阻止了这两种测量工具之间的差异达到零。一个合适的终点标准应高于压力波动引起的差值。该值还应足够低，以确保在切换到下一个冻干步骤之前，两个显示压力之间的差异在给定的时间内最小。听起来很简单。但是如何真正建立一个合适的终点标准呢？为了找到合适的压差，我们使用测试方案进行多次测试：我用甘氨酸溶液（去离子水中 5%W/V）作为试验溶液。将溶液在 -40°C 下冷冻 24 小时以上，并在冷冻干燥机上以 0.3mbar 的压力进行干燥。重要的是，在每次冻干循环之前，应进行真空试验，以校准皮拉尼压力计。此步骤是强制性的，以确保皮拉尼压力计在干燥阶段前后显示正确的压力。为了找到一个合适的终点标准，我以不同的压差作为终点标准进行了多次试验。当隔板的温度与样品的温度一致，两个压力计的压力合并时，终点检测成功。结果如下图所示：上图所示为压差为 0.05 mbar 的结果，中间图为 0.03 mbar，底图为 0.025 mbar 作为终点标准。在达到终点标准之前，压差至少保持 60 分钟。隔板温度用黄线表示，样品温度用红线表示，干燥箱压力用绿线表示，皮拉尼压力计在初级干燥（白色阴影）和二级干燥（灰色阴影）上用蓝线表示。同时显示达到压力（黑线）和温度终点标准（黑色虚线）的时间，以及该点相应的温度和压力差。结果表明，只有在压差为 0.025mbar 的循环中，压力曲线和温度曲线在切换到二级干燥之前同时合并。在 0.30 mbar 的设定压力下，0.025 mbar 或更小的压差保持 60 分钟以上可被视为合适的终点标准。对于简单的甘氨酸溶液来说，这没问题，但是对于那些需要二级干燥的更具挑战性的样品呢？嗯，我决定用美味的草莓进行冷冻干燥实验。草莓在 -40°C 下冷冻 24 小时以上，并在 0.3 mbar 的压力下冷冻干燥，初级干燥时隔板温度为 25°C，二级干燥时为 40°C。选择 0.025mbar 的压差作为终点标准。最大的草莓带着一个热电偶，这样样品的温度就可以与隔板温度相比较。上图显示了整个冻干循环，下图显示了二级干燥步骤的截取图。隔板温度用黄线表示，样品温度用红线表示，干燥箱压力用绿线表示，皮拉尼压力计用蓝线表示。图中的白色阴影表示初级干燥，而灰色阴影表示二级干燥。同时还显示了达到终点标准（黑线）的时间以及该点对应的温差。另，下图中的顶部线显示 37 小时后到达终点。此时，温度曲线和压力曲线在循环转换为二级干燥之前同时合并。在草莓的二级干燥过程中，当隔板温度升高（下图）并开始蒸发时，皮拉尼压力计出现一个明显的峰值。当使用温度测量来确定终点时，通常会忽略这个峰值，这表明了比较压力测量可以用于评估具有挑战性的样品的终点标准。我想指出的是，一个合适的终点标准是高度依赖于冷冻干燥循环中的干燥箱室压。这是因为干燥阶段的压差不是绝对的，但始终是在 60% 的室压下。因此，如果冷冻干燥方法的干燥腔室压力发生变化，则需要重复实验过程寻找适当终点标准。二级干燥阶段的终点标准也应适用。在这里，最大压差通常不会达到干燥箱压力的 60%，因为样品中只剩下小部分水。与一级干燥相比，考虑较小的压差可能是有必要的，压差需要持续较长的时间，作为二级干燥的终点标准。这种方法也应该首先通过测试运行来验证。抱歉，我要去吃午饭了。这一次，我将尽量保持我的腹部和裤子之间的压力差达到最小。希望您能对更多的冻干和色谱知识保持渴望，并继续通过步琦学堂满足您的胃口。下次见！扫描左侧二维码可直接拨打电话联系我们或直拨：400-860-5168 分机号：0728仪器信息网认证，请放心拨打

揭示生物学样本和材料样本原本无法观察到的内部结构冷冻断裂是一种将冰冻样本劈裂以露出其内部结构的技术。冷冻蚀刻是指让样本表面的冰在真空中升华，以便露出原本无法观察到的断裂面细节。金属/碳复合镀膜能够实现样本在SEM（块面）或TEM（复型）中的成像，主要用于研究如细胞器、细胞膜，细胞层和乳胶。这项技术传统上用于生物学应用，但现在逐渐在物理学和材料科学中展现出重要意义。近年来，研究人员通过冷冻断裂电子显微镜，尤其是冷冻复型免疫标记（FRIL），对膜蛋白在动态细胞过程中所发挥的作用有了新的见解。作者：Gisela Höflinger图1：麦叶上的蚜虫适合于电子显微镜的环境电子显微镜的样品室通过抽真空处理降至极低压力。置于这种环境下的活细胞无法有效保全结构，因为细胞构成中的大部分水分会快速蒸发。生物样本的制备方法有很多种。样品材料被（固定）保存，这样后续脱水对原位结构的破坏最小，同时可以使用环境扫描电镜（SEM）或者将水冷冻。高压冷冻是观察自然状态下含水结构的唯一方法。高压冷冻所形成的冰不是六边形冰（从水变为六边形冰时体积会增加）而是无定形冰，因此体积保持不变。所以，对渗透和温度变化敏感的结构得以保留（见文章“高压冷冻基础介绍”）。要观察诸如细胞器、细胞膜、乳胶或液体的表面界面等结构，冷冻断裂是唯一的方法。通过刀片（或类似物）或释放弹簧负载的外力来破开冷冻样本，并沿着最小阻力线断裂样本。图2：冷冻断裂（来源：http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Lipids/Membrane_Fluidity） 水的升华与凝结 – 冷冻蚀刻与污染要暴露冷冻断裂面，需要把冰去除。这就需要通过把断裂面的冰升华去除以保存样品的结构。升华的过程是冰不经过液态过程直接转化为气态。而液态过程会导致样品体积和结构的破坏。图3：ES，细胞外表面；PF，细胞膜冷冻断裂面；EF，细胞膜外层冷冻断裂面；FS，细胞膜内表面；Cyt，细胞质水的升华/冷凝过程取决于特定温度下的饱和压力，以及水或冰在室内的有效水分压。注意：良好的真空度会降低水分压。例如：温度为-120℃的冰或冰冻样本饱和压力约为10-7 mbar。如果样品室内达到这个压力，则冷凝和蒸发处于平衡状态。蒸发的分子数量等于冷凝的分子数量。在更高压力下，冷凝速度要快于升华速度 – 因此冰晶会在样本表面上生长。必须采取一切手段来避免这种情况。样本上方一个较冷（比样本更冷）的冷阱会降低局部压力，从而起到了冷凝阱的作用。从样本中带出的水分子优先附着在较冷的表面上。在低于饱和压力的压力下，更多的分子升华而不是冷凝，同时会发生冷冻蚀刻。执行冷冻蚀刻直到样本完全无冰，这一过程称为冷冻干燥。仅适用于合理时间内执行的小样本。该过程分为几个步骤，需要从大约-120℃加热到-60℃，同时在每个步骤上使温度保持一定时间。该过程需要几天的时间来完成。图4：饱和蒸汽压力（感谢Umrath 1982提供的图片）样本温度低于-120℃时，蚀刻速度非常慢，蚀刻持续时间会增加到不切实际的程度。如果真空室的压力固定，则可以通过提高样本温度来提高蚀刻速度。对于生物样本，要特别小心温度高于-90℃。蚀刻速度会大幅提高。另外，要注意玻璃态冰中形成六边形冰晶从而导致脱水伪像。纯水的理论升华速度会降低，因为：• 样本深处的水升华速度比表面的水更慢。• 盐和大分子溶剂会降低升华速度。• 生物样本中大量存在的结合水会降低升华速度。通过冷冻断裂生成图像冷冻断裂和冷冻蚀刻技术往往采用高真空精细镀膜技术，将超细腻重金属和碳薄膜沉积于断裂表面。冷冻断裂样本在一定角度下用金属覆盖，然后在碳背衬膜（徕卡EM ACE600冷冻断裂或徕卡EM ACE900与徕卡EM VCT500）上生成复型进行TEM成像或在SEM的试块面上进行成像。对于这两种方法，冷冻断裂表面经过一定的蚀刻时间后以相同的方式进行镀膜。首先在一定角度下进行一层薄的（2-7nm）重金属镀膜，以形成地形对比度（阴影）。其次再针对重金属薄膜，在90°下进行一层厚的碳层（15-20nm）镀膜，以稳定超薄电子束蒸发。此时的蚀刻处理会停止。要对极小的结构进行成像，需要在极低的角度（2–8°）镀膜重金属并在镀膜期间旋转样本。这样可增加细丝状及其它细小结构的对比度。此项技术又称为小角度旋转投影。蒸镀重金属薄膜需要采用电子束蒸发镀膜技术。这种镀膜技术可实现精细定向沉积。碳的支撑层稳定了未被金属覆盖的结构。随着温度的升高，这些结构会改变它们的轮廓，样本不会完全导电，复型也不会粘在一起。冷冻断裂酵母的单向投影图5：低温SEM，BSE（背散射电子）图像。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。图6：复型，TEM图像（感谢Electronmicroscopy ETH Zürich提供图片）。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。图7：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。油/水基样品，–100℃（升华）3分钟暴露油脂结构。图8：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。原生生物游仆虫混合培养的羽纹硅藻。感谢英国波特斯巴NIBSC的Roland Fleck博士提供图片图9：徕卡冷冻断裂系统及徕卡真空冷冻传输至低温SEM的HPF、冷冻断裂、冷冻蚀刻和低温镀膜。油/水基乳液破裂，露出洋葱状薄片结构，形成液滴。感谢汉堡拜尔斯多夫Stefan Wiesner博士提供的图片。图10：TEM中的酵母细胞复型。经徕卡高压冷冻和徕卡冷冻断裂复型制备。感谢Elektronenmikroskopie ETH Zürich提供的图片。图11：大麦叶上的真菌。安装于徕卡冷冻断裂仪样本台上，并通过冷却样本台在液氮下进行冷冻。徕卡冷冻断裂仪对样品进行部分冷冻干燥（在更高的样本温度下冷冻干燥）。使用钨镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温FESEM 5keV。相关产品徕卡EM ACE900 高端EM样本制备冷冻断裂系统徕卡EM VCT500了解更多：徕卡官网

（1）生物制品的冷冻真空干燥我们做过生物制品冷冻真空干燥的品种有皮肤、角膜、海参、螺旋藻等；从文献中看到其他人做过的冻干产品有心瓣膜、活菌、活毒、骨骼、各种疫苗、血液制品等。生物制品的冻干要求保持产品的活性，活菌、活毒等微生物真空干燥后的存活率要求80%以上，以便于应用。因此，对冻干机工艺要求严格，预冻温度、速度、时间的控制很不容易，保护剂配方、剂量、加入时间和加入方法非常关键，不同的人可能采用不同的配方，达到的效果可能相同。一般各种保护剂的配方都是互相保密的。（2）药材和药品的冷冻真空干燥我们做过的品种有人参、山药、纳豆激酶、北冬虫夏草、林硅油、鹿茸等；从文献中看到其他人做过的品种有各种粉针制剂、中草药制剂、抗生素、布洛芬、脂质体和其他纳米颗粒等。药材和药品需要长期保存，真机需要速溶，放置氧化，避免污染杂菌，保持药效的长久稳定。这些要求都需要通过冷冻真空干燥技术来实现。药材和药品的冷冻真空干燥工艺要求也很严格，寻找合适的冻干保护剂、添加剂、赋形剂都很困难，生化干燥阶段的温度控制、加热速率控制都很关键，严格防止塌陷。（3）食品的冷冻真空干燥我们做的食品有菠菜、苹果、香蕉、库尔勒香梨等；从文献上查到其他人做过的品种有咖啡、茶叶、大蒜、鱼肉、调料等。食品种类繁多，形状、性质相差较大，冻干工艺需要在实验中确定。冻干食品时间较长、耗能较多、价格较高，应该合理选择冻干参数，优化冻干过程，降低冻干昂成本，根据市场需要，选择性价比较高的食品做冷冻真空干燥。（4）冷冻真空干燥在其它领域的应用冷冻真空干燥除了在生物制品、药品、食品和纳米材料制备方面的应用之外，还可以干燥超市的木质文物、古画等，冻干发出来的这些产品能恢复物品的原样；还可以干燥动植物标本，使标本长期保存，栩栩如生；医疗事业做实验用的、具有毒害物质的动物尸体采用冻干干燥法的处理，可以实现环保等。