冷冻电子断层扫描

p style="text-indent: 2em "strong style="text-indent: 2em "仪器信息网讯/strongspan style="text-indent: 2em " 12月16日，由国家蛋白质科学研究（北京）北大分中心、北京大学生命科学学院和赛默飞世尔公司共同主办，中国生物物理学会冷冻电子显微学分会承办的2020年蛋白质冷冻电子断层扫描三维重构技术应用研讨会在北京大学中关新园成功举办。研讨会主席由北京大学郭强研究员、高宁教授、伊成器教授和赛默飞电镜生命科学亚太区市场拓展总监Eric Fung Chen共同担任，主题是“蛋白质冷冻电子断层扫描-桥连细胞生物学和分子生物学时代”，围绕三维冷冻电子断层扫描重构技术（Cryo-ET）样品制备、算法数据处理、应用以及交联质谱、FCS技术等方面进行了广泛研讨。本次研讨会共组织安排了11场精彩报告，其中来自德国马普生化所冷冻电子断层扫描技术的先驱Wolfgang Baumeister教授应邀作了主旨报告。作为冷冻电子断层扫描三维重构技术盛会，会议吸引了来自全国高等院校、科研院所、企事业单位的知名专家学者等共240余人。/span/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 400px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/7f9c68cf-1c1c-4fad-a95f-f2a154a2a686.jpg" title="1.jpg" alt="1.jpg" width="600" height="400" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em "全体合影/span/pp style="text-indent: 2em "strong北京大学生命学院副院长高宁教授/strong和strong赛默飞材料与结构分析业务高级商务总监陈厅行/strong分别为大会致开幕辞。高宁教授指出在过去几年内，冷冻电镜技术的革命性发展非常深刻的改变了生命科学很多领域的研究范式。冷冻电镜技术未来的一个重要突破将是冷冻电子断层扫描三维重构技术（Cryo-ET），这些技术发展离不开国家层面鼓励的多学科交叉的方向。将来除了生物学、电子显微学还有材料、化学、大数据技术、人工智能等各学科的深度融合，我们坚信在5 ~ 10年内各项基于冷冻电镜的技术，特别是冷冻电子断层扫描三维重构技术将迎来新的突破，这将是一个新的革命性的时代，在座学生可以做好迎接新时代的准备。陈厅行在致辞中表示赛默飞在结构生物学领域和北大以及国家蛋白质中心都一直有着非常密切的合作，从仪器、服务到技术的普及和相关的学术活动。他希望凭借赛默飞仪器技术的升级能帮助科学家们攻克一个又一个的生物学问题，探究更多的人类的未解之谜，让我们的世界更健康，更清洁，更安全。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 199px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/93502dfe-279d-4ace-a365-a45683d57aab.jpg" title="2.png" alt="2.png" width="600" height="199" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em "高宁教授（左）和陈厅行先生（右）/span/pp style="text-indent: 2em "随后在上午的学术报告中，strong清华大学欧光朔教授/strong报告了利用Cryo-ET技术研究线虫肠道内纤毛和微绒毛的最新研究成果。报告中，欧教授详细报告了如何从使用常温FIB-SEM研究线虫的大尺度三维重构的过程到使用Cryo-ET技术过程。在使用Cryo-ET技术过程，经历了很多艰辛，由于定位问题，很难获得高质量理想样品。最后在研究线虫肠道上皮内有大量的微绒毛过程中，非常意外的发现在小肠微绒毛膜的外面有成百上千的杆状结构。由于该茸毛存在于微米级细胞器Microvilli上，其直径5nm，长度35nm长，因此命名为Nanovilli，报告中将Microvilli和Nanovilli组成的结构形象的称之为狼牙棒（Rod with wolf teeth）结构。通过大量的数据分析并结合文献中微绒毛再生过程的研究结论，提出了微绒毛复制模型。欧教授幽默风趣的报告，赢得了阵阵掌声。/pp style="text-indent: 2em "strong中国科学院生物物理研究所章新政研究员/strong报告了新的高通量原位结构解析技术，该技术的定位效率与蛋白质大小和样品厚度密切相关，在低于120 nm的非切片数据里，可定位400 kD以上的蛋白并实现高分辨率解析。蛋白质的丰度和蛋白质分子量降低都会影响定位效率，但前者远小于后者的影响。经估算，在丰度极地的情况下，若切片厚度在100 nm左右，可解析约1 MD的蛋白高分辨率结构。由于相对较低的定位效率，算法无法确定原位环境中的蛋白复合物，因此如果目标蛋白的分布未知，可先收集Tomographic数据，通过Sub-Tomogram averaging技术研究蛋白在原位环境中的分布，然后使用该方法进一步提升分辨率。/pp style="text-indent: 2em "strong赛默飞电镜生命科学亚太高级业务拓展总监Eric Fung Chen/strong在会议上介绍了赛默飞多年以来持续在产品技术研发上做的大量投入，以及冷冻电镜在生命科学领域的技术新进展。赛默飞每年在持续在产品研发投入超过10亿美金，这使得赛默飞的技术创新一直走在科技的前沿：新推出的Selectris能量过滤器将冷冻电镜提升到了新的水平，分辨率可达1.2埃，实现了以真正的原子级分辨率观察蛋白；Aquilos 2 cryo FIB在样品制备方面进行了自动化改进和提供了细胞组织水平的冷冻薄片提取技术，从而大大简化了研究人员的制样步骤，提高了成功率；亲民新品Tundra（100kv CryoEM）也使得更多的客户有能力用冷冻电镜研究蛋白结构，最新数据是分辨率达到3.0埃（Apoferritin)等，所有的这些创新都是希望帮助科学家们解决更多的科学难题，实现科研往前推动重要的一步。/pp style="text-indent: 2em "strong北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院董梦秋研究员/strong报告了利用化学交联及质谱分析辅助蛋白质结构分析，其团队开发了一种新可以在具有挑战条件下工作的交联剂DOPA2，该交联剂具有氨基特异性，可以在10 s内快速反应完成交联，远远快于目前常用交联剂的反应时间20 ~ 30min，而且不水解。该交联剂不仅可以使化学交联质谱分析用于分析未折叠或部分折叠的蛋白质，还可以捕捉蛋白质展开过程中的结构变化，最后她也希望在蛋白构象变化研究的路上，未来能研究出反应更快的交联剂，甚至是微秒级的交联剂，以更好研究跟踪更快的蛋白构想变化。/pp style="text-indent: 2em "strong北京大学生命学院郭强研究员/strong报告了利用冷冻电子断层扫描技术分析神经退行性疾病的细胞毒性分子机制。报告中列举了通过冷冻光电联用技术，电子断层扫描技术实现对多种神经退行性疾病模型中的蛋白聚集物的原位观察，展示了蛋白聚集物多样性的特征，并指出泛素化降解途径功能阻滞可能是ALS发病过程中的重要特征。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 500px height: 375px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/f5144e7b-680e-48c0-8a89-823a6a1f418b.jpg" title="3.png" alt="3.png" width="500" height="375" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em "上午报告人/span/pp style="text-indent: 2em "下午学术报告中，strong北京大学生命学院王世强教授/strong首先带来了精彩的报告。王老师虽然自己以前不是做结构相关的，但是王老师实验室使用电镜方面，有非常长的历史。一旦电镜有些新的技术，他都会让学生在第一时间尝试。在之前北大硬件相对比较差的时候，他就找各种的合作，试图用相对比较有限的条件应用最新的技术。王教授报告了使用常规Tomography技术获得的心肌细胞内钙信号转导大分子复合物signosome的三维结构并详细介绍了钙火花工作机制。/pp style="text-indent: 2em "strong清华大学李雪明副教授/strong报告了细胞原位冷冻电镜结构解析的技术挑战与研究进展，报告中指出，Cryo-ET的优势是可以研究真正的生理态状态、大尺度范围内的物质相互作用、涵盖了关键的生物学过程、分辨率可以从原子尺度到微纳尺度。同时从样品制备技术、数据采集、数据预处理、三维重构、图像识别（深度学习）系统介绍了冷冻电子断层扫描三维重构技术。特别是样品制备方面是Cryo-ET面临的瓶颈问题，决定了实验的成败。李教授详细汇报了课题组切割样品的过程，切割必须保持样品高质量的结构、定位问题、表面辐照损伤、切割的厚度、形变等等都会影响样品质量。未来高效智能的Cryo-ET技术依然是其努力方向。/pp style="text-indent: 2em "strong中科院计算技术研究所张法/strong研究汇报了电子断层三维重构中的计算方法，详细列举了研究组开发的数据对中（Markerauto）、弥补数据缺失重构（FIRT/ICON和Curvilinear projection Model）、三维体降噪和三维数据分类等软件的原理、优势及应用。生物物理所黄韶辉研究员报告了基于最大熵值法的荧光寿命相关光谱技术（FCS）用于分析生物分子亚毫秒级别的动态结构变化，其应用最大熵值法(MEM)可实现对均相溶液样品中三个荧光组份(三个FRET构象)的荧光寿命分布分析；而且应用荧光寿命相关光谱(FLCS)技术实现对以上三个FRET构象相互转换在亚毫秒时间尺度的动力学研究。同时他还希望能对溶液样品中更多( 3)FRET构象及其相互转换的动力学研究、数个毫秒级别的构象转换动力学研究以及解决更有意义的生物学问题。其自主研制的FCS CorTectorTM SX100国内外用户有美国国立卫生研究院、加州大学旧金山分校、清华大学、中科院生物物理研究所，他也期待和大家有更多的合作。/pp style="text-indent: 2em "仪器行业新锐strong荷兰Delmic公司的CEO Sander den Hoedt和冷冻电镜产品部主管Katherine Lau/strong在中国区总代理超微动力公司总经理葛鹏的协助下详细介绍了一款有巨大潜在应用价值的新产品Meteor。这是一款集成于cryo-FIB/SEM上的荧光显微镜实时观察系统，该系统可以减少样品转移环节，显著提高制样成功率和良品率，将宝贵的冷冻电镜机时用于真正有价值的样品。在报告中还提及了Delmic公司的另一项新产品——全自动高速电镜系统FastEM。这也是一款革命性的新产品，使电镜观察实现完全自动化，可将电镜的观察效率提高数十倍。这些产品的潜在应用价值得到主旨报告人Baumeister教授的充分肯定。/pp style="text-indent: 2em "strong马普生化所Baumeister教授/strong首先介绍了原位结构生物学的重要意义，接下来回顾了过去几十年冷冻电子断层扫描技术相关上下游仪器设备的发展历程。紧接着，介绍了研究组近期利用电子断层扫描技术解决的生物学问题，涵盖了神经生物学、光合成、相分离、细胞自噬、蛋白稳态等多个方面。最后，展望未来，Baumeister教授讲述了原位结构生物学未来需要解决的方法学难题及发展方向。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/a5f3d902-6910-42e2-b146-33b8f7418ffa.jpg" title="4.png" alt="4.png"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em "下午报告人/span/pp style="text-indent: 2em "本次研讨会为国内学者提供了冷冻电子断层扫描三维重构技术的高水平交流平台，有效推动了蛋白质结构与功能研究的进步和发展。一天的交流，与会代表积极参与讨论，大家感受到了Cryo-ET技术的魅力与发展。郭强研究员最后期待在更大的会场和更多的学者可以进行更多的学术交流。本次研讨会得到了北京大学冷冻电镜平台的大力支持。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 265px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/93f7b2bb-cc72-4afc-b575-9eb5afb165e8.jpg" title="5.png" alt="5.png" width="600" height="265" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em "会议掠影/span/p

p style="text-align: justify text-indent: 2em "冷冻电子断层扫描技术是目前唯一可以在细胞生理状态下，对生物大分子和亚细胞结构在分子分辨率（1~10 nm）水平进行原位结构分析和功能研究的技术手段。这一研究尺度正是目前传统细胞生物学和分子生物学都无法涵盖的，因此这一技术是桥连两者的关键技术。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "近年来，伴随着聚焦离子束（FIB）、光镜电镜联用（CLEM）和相位板等技术手段的发展，冷冻电子断层扫描技术已经可以实现对不同亚细胞结构、细胞生物学现象进行原位观察。与此同时，相机成像质量的进步、计算能力的提升和算法的优化使得该方法可实现的分辨率大幅度提升，甚至可以做到亚纳米分辨率乃至原子分辨率的原位结构解析。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "基于这些发展，冷冻电子断层扫描技术对生命科学研究有两方面助力：一方面，对细胞生物学现象观测的空间分辨率提升一到两个数量级，这将有可能重塑我们对细胞生物学的认识；另一方面，相对传统结构生物学，在牺牲一定分辨率的代价下，可以对生物大分子在其生理状态下进行原位结构分析，获得其构象、功能及细胞微环境的关联，这将是生物学未来的重要发展方向。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "本次研讨会由国家蛋白质科学研究（北京）北大分中心、北京大学生命科学学院和Thermo Fisher Scientific公司共同主办，将围绕蛋白质三维冷冻电子断层扫描重构技术，从样品制备、数据收集、算法数据处理、应用等方面进行广泛研讨。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong会议主题：/strong/span蛋白质冷冻电子断层扫描-桥连细胞生物学和分子生物学时代/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong会议日期：/strong/span2020年12月16日9:00 - 17: 00/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "会议地点：/span/strong北京大学中关新园群英厅/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong会议规模：/strong/span150人/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong主办单位：/strong/span国家蛋白质科学研究（北京）北大分中心、北京大学生命科学学院、Thermo Fisher Scientific公司/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong会议主席：/strong/span郭强、高宁、伊成器/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong本次会议免费参加。请您将参会回执发送至aiwenfan@pku.edu.cn，邮件注明“xx参加蛋白质冷冻电子断层扫描三维重构技术应用研讨会”，以便安排用餐。/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "附件：img src="/admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_doc.gif" style="vertical-align: middle margin-right: 2px "/a href="https://img1.17img.cn/17img/files/202012/attachment/ff5916c6-1cd7-436a-95aa-87ba62efda59.doc" title="参会回执.doc" style="font-size: 12px color: rgb(0, 102, 204) "参会回执.doc/a/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong会议联系人：/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "郭振玺：北京大学生命学院，13466664284，guozhenxi9999@pku.edu.cn/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "范爱文：北京大学生命学院，13051380795，aiwenfan@pku.edu.cn/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "郝雪梅：北京大学生命学院，15811335516，haoxm@pku.edu.cn/pp style="text-align: right "北京大学/pp style="text-align: right "2020年11月30日/ppbr//p

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种能在细胞内寄生生活的寄生虫，它能够感染包括人在内的几乎所有温血动物，引发弓形虫病。处于速殖子阶段的弓形虫在宿主细胞内进行无性繁殖，即：母体细胞的细胞核附近产生两个子代弓形虫，后者会逐渐发育为成熟的速殖子，而母体细胞的结构随之消失。弓形虫速殖子具有表皮下微管（SPMTs）和类锥体（conoid）等骨架结构，在维持细胞形态、运动和侵染宿主过程中发挥重要作用。先前的相关研究主要聚焦于弓形虫成熟速殖子及其骨架结构，描述了细胞骨架在成熟速殖子中的分布情况，并通过冷冻电镜分别解析了表皮下微管和类锥体纤维的精细结构，揭示了表皮下微管是由13根原丝组成的“句号”形状；而类锥体纤维是由9根原丝组成的“逗号”形状 (Sun et al., 2022)。而对弓形虫速殖子增殖过程的结构研究目前仍以荧光显微技术为主要手段，缺少更高分辨率的结构。该增殖过程区别于常见的细胞“一分为二”的有丝分裂方式，存在大量未知的细节值得去探索。2023年2月25日，北京大学生命科学学院郭强课题组在Advanced Science发表了题为“Cryo-Electron Tomography of Toxoplasma gondii Indicates That the Conoid Fiber May Be Derived from Microtubules”的研究论文。该工作首次将冷冻电子断层成像技术应用于探究弓形虫速殖子的增殖过程，在纳米尺度下详细描述了子代弓形虫的三维原位结构，并在结构方面提供了类锥体可能起源自微管的证据。该研究利用了冷冻电子断层成像（cryo-ET）并结合了聚焦离子束（FIB）技术，获得了成熟速殖子及其细胞核附近新生的子代弓形虫的原位结构。作者分别展示了纳米尺度下的成熟和子代速殖子顶部复合物的三维结构（图1 B和H），重点描述了细胞骨架相关结构的细节，发现子代速殖子在早期就已经具备完整的细胞骨架结构，印证了荧光显微技术的研究结果。通过对比，作者发现成熟与新生速殖子的细胞骨架在空间分布上存在差异，猜测这可能与子代速殖子发育过程中所处的环境与成熟速殖子不同有关。让人意外的是，研究者发现子代速殖子的类锥体纤维中同时存在“句号”形状和“逗号”形状这两种结构。这两种形状能够同时出现在同一根类锥体纤维上（图1 C），并且存在一段约10 nm长、由“句号”形状向“逗号”形状过渡的区域。进一步计算表明“句号”形状的类锥体纤维由13根原丝组成（图1 C），与微管一致；基于两者在结构上的相似性，且两者都主要由tubulin蛋白组成，推测类锥体纤维可能起始于微管，其在成熟过程中失去4根原丝，并逐渐转变为最终的“逗号”形状（图1 I）。该研究有助于我们更深入地理解类锥体的组装，以及弓形虫增殖时子细胞从产生到逐渐成熟的过程，为进一步探寻弓形虫及其他顶复门寄生虫控制药物提供支持。图1 （A-C）来自弓形虫子代速殖子，（G-I）来自成熟速殖子。（A-B和G-H）为类锥体附近区域的结构。（C和I）为类锥体纤维不同位置的横截面。北京大学生命科学学院、生命科学联合中心郭强研究员为该研究的通讯作者。课题组20级PTN项目博士研究生李智勋为该研究的第一作者，课题组技术员杜文静，以及中山大学伦照荣教授，赖德华副教授和杨炅同学为该工作做出了重要贡献。该工作中冷冻电镜样品制备和数据采集在北京大学冷冻电镜平台完成。数据处理获得了北京大学未名超算平台的硬件和技术支持。北京大学国家蛋白质科学中心的工作人员提供了技术支持。该研究得到了北京大学生命科学中心（CLS）、生命科学学院（SLS）、SLS-启东创新基金以及昌平实验室的经费支持。参考文献：Sun, S.Y., Segev-Zarko, L.-a., Chen, M., Pintilie, G.D., Schmid, M.F., Ludtke, S.J., Boothroyd, J.C., and Chiu, W. (2022). Cryo-ET of Toxoplasma parasites gives subnanometer insight into tubulin-based structures. Proceedings of the National Academy of Sciences 119, e2111661119.研究组介绍郭强：北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心，研究员、博士生导师。实验室研究领域：我们是原位结构生物学实验室。关注“细胞建筑学”：各个亚细胞结构是如何搭建成一个具有完整生物学功能的细胞，以及“生物大分子社会学”：细胞内的细胞器、生物大分子之间的相互关系。原位结构生物学是基于冷冻光电联用（CLEM）、冷冻电子断层扫描（cryo-ET）等技术的新兴结构生物学分支，是一种可以在细胞生理状态下，对生物大分子和亚细胞结构在分子分辨率（1 ~ 10 nm）水平进行原位的结构分析和功能研究的技术手段。我们主要研究方向包括：1. 在纳米、亚纳米尺度对基础细胞生物学问题的研究。2. 对包括神经退行性疾病在内的老龄化疾病致病机制的研究。3. 适用于组织样品的高分辨原位结构生物学方法优化。