α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060703300197945](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060703300197945.png)
溶液的配制:
1.试剂八:临用前加入 0.8 mL 双蒸水充分混匀待用,用不完的试剂仍-20℃避光保存。
2.工作液的配制:临用前把试剂四、试剂五、试剂六、试剂七转移到试剂三中混合溶解待用。
产品说明:
α-KGDH(EC 1.2.4.2)广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中,是三羧酸循环调控关键酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH,NADH在340 nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
称取约 0.1g 组织或收集约 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂二,冰浴用匀浆器或研钵充分研磨,4 ℃ 11000g 离心 10min,取上清,置冰上待测。
二、操作步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 空白管:
取200μL工作液加入微量石英比色皿或96孔板中,37℃孵育5min后取出比色皿,再依次加入8μL试剂八和12μL蒸馏水,混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A1,37℃准确反应2min,记录340nm处2min时的吸光值A2,计算ΔA空白=A2-A1。
3、 测定管:
取200μL工作液加入微量石英比色皿或96孔板中,在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min后取出比色皿,再依次加入8μL试剂八和12μL样本,混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A3,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中准确反应2min,记录340nm处2min时的吸光值A4,计算ΔA测定=A4-A3。
三、α-KGDH活性计算
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![image 2022060703311179029](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060703311179029.png)
V反总:反应体系总体积,2.2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.6cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入试剂一和试剂二体积,1.01mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
注意事项:
1、 测定过程中所有试剂和样本在冰上放置,以免变性和失活。
2、 比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃,取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水,将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、 最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
4、 测定管的 ΔA 值在 0.01-0.25 之间,若测定管的 ΔA 值大于 0.25,需将样本进行稀释。
5、 由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
实验实例:
1、 取0.1g稗草进行样本处理,将取上清稀释2倍后按照测定步骤操作,使用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A4-A3=0.3243-0.3115=0.0128,ΔA 空白=A2-A1=0,按样本质量计算酶活得:
α-KGDH(U/g 质量)=1488.5×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W×2(稀释倍数)=381.056 U/g 质量。
2、 取 0.1g 小鼠肝脏进行样本处理,4 ℃ 11000g 离心 10min,取上清后按照测定步骤操作,使用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定=A4-A3=1.2123-0.9623=0.2500,ΔA 空白=A2-A1=0,按样本质量计算酶活得:
α-KGDH(U/g 质量)=1488.5×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W=3721.25 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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