TOYOPEARL Phenyl FT-750FTOYOPEARL Phenyl FT-750F 是一款疏水层析填料，在低盐浓度下也能进行分离。在流穿模式下对抗体中多聚体的去除效果非常好。在洗脱模式下也能适用，但此款填料孔径较大，更适合用来分离超大分子样品。特点专为在流穿模式下纯化抗体而开发的疏水层析填料即使在低盐浓度洗脱条件下也能有效去除多聚体在洗脱模式下也能进行分离填料孔径大，适合分离超大分子的生物样品主要应用抗体含有多聚体的蛋白质质粒 DNA、病毒等生物大分子疏水层析填料TOYOPEARLPhenylFT750F产品介绍单页.pdf

    为了应对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引发的世界性大规模病毒感染（COVID-19）（大规模流行病），各个国家/地区都在加速新冠疫苗的研发。虽然现在已经有21种新冠疫苗获得批准，但供应量仍然不够。因此，很多国家/地区选择委托合同生产机构（CMO）进行疫苗生产。新冠疫苗的纯化会使用到各种层析法。下表是已获批上市的新冠疫苗，以及可在其纯化工艺中使用的TOYOPEARL制备层析填料的相关内容。● 已获批上市的新冠疫苗企业及研究机构研发产品 / 产品名称种类审批情况*国家及地区AstraZeneca、University of OxfordAZD1222 (ChAdOx1 nCoV-19)腺病毒批准英国、欧洲等119个国家CanSino Biologics、Beijing Institute of BiotechnologyAd5-nCoV腺病毒5批准中国等8个国家Gamaleya Research InstituteSputnik Light/Sputnik V腺病毒5, 26批准俄罗斯等70个国家Johnson & Johnson/Janssen PharmaceuticalsAd26 CoV2-S腺病毒26批准美国等55个国家Serum Institute of India, SpyBiotechRBD-HBsAg VLP/CovishieldVLP批准印度等44个国家Sinovac BiotechPiCoVacc灭活病毒批准中国等37个国家武汉生物制品研究所、Sinopharm-灭活病毒批准中国北京生物制品研究所、SinopharmBBIBP-CorV灭活病毒批准中国等56个国家Bharat BiotechBBV152/Covaxin灭活病毒批准印度等9个国家Research Institute for Biologial Safety ProblemQazCOVID-In® /QazVac灭活病毒批准哈萨克斯坦Chumakov CenterKoviVac灭活病毒批准俄罗斯北京民海生物科技SARS-CoV-2 Vaccine灭活病毒批准中国Shifa Pharmed Industrial Co.-灭活病毒批准伊朗BioNtech、Fosun Pharma、PfizerBNT162mRNA批准美国、欧洲、日本等93个国家Moderna, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), TakedamRNA-1273/TAK-919/SpikevacmRNA批准美国、欧洲、日本等63个国家Center for Genetic Engineering and BiotechnologyCIGB-66蛋白质批准古巴Anfui Zhifei Longcom Biopharm, Inst. Microbiol. Chinese Academy of SciencesRBD-Dimer/ZIFIVAX蛋白质批准中国、乌兹别克斯坦Vektor State Research Center of Virology and BiotechnologyEpiVacCorona蛋白质/肽批准俄罗斯、土库曼斯坦MedigenMVC-COV1901蛋白质批准中国台湾* 以上是截至2021年7月26日的数据，并进行了部分修改。包括“特例批准”和“紧急批准”。Ref.: WHO, Draft landscape of COVID-19 candidate vaccines, https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccinesCovid-19 Vaccine Tracker; https://covid19.trackvaccines.org/vaccines/● 可用于纯化新冠疫苗的TOYOPEARL填料示例疫苗分离模式可使用的TOYOPEARL产品*文献编号Spike蛋白疫苗SECHW-55S1-5IECGigaCap Q-650M, GigaCap DEAE-650M, SuperQ-650M, NH2-750FHICButyl-650S, Hexyl-650CAFCAF-Chelate 650M (Ni2+ or Co2+)，（活化型亲和填料，用于凝集素-AFC）病毒载体疫苗SECHW-65F6-10IECGigaCap Q-650M, GigaCap DEAE-650M, SuperQ-650M灭活病毒疫苗SECHW-65F11-5IECGigaCap Q-650M, GigaCap DEAE-650M, SuperQ-650M, NH2-750FmRNA/DNA疫苗IECGigaCap Q-650M, GigaCap DEAE-650M, SuperQ-650M, NH2-750F16-20HICPPG-600M, Phenyl-600M/650M, Phenyl FT-750F, Butyl-600M/650M, Hexyl-650CMXCCa++Pure-HA® （羟基磷灰石）AFC（Oligo-dT-AFC等无相关产品）* 根据具体情况，也可使用不同粒径等级的产品（S, M, C, F等级等）。还可使用高速制备TSKgel® PW系列填料。在疫苗纯化中，一般会使用尺寸排阻层析（SEC）、离子交换层析（IEC；主要是阴离子交换层析）和疏水层析（HIC），而在Spike蛋白疫苗的纯化中，在纯化末端添加了His-Tag标记的重组蛋白质时，可使用金属螯合亲和层析（IMAC），在纯化mRNA/DNA疫苗时，还可使用羟基磷灰石等多（混合）模式层析（MMC, MXC）填料。● 用于工艺开发和筛选的预装柱SkillPakTM在工艺开发的早期阶段需要进行制备填料的筛选和分离条件探讨/优化，使用容量1 mL或5 mL的预装柱SkillPak，可更加迅速、准确地进行评估。套装产品包含不同模式的各种层析柱，非常有利于层析工艺开发。（产品网页：https://www.separations.asia.tosohbioscience.com/productjp/process/prosdev）● 参考文献 （注）参考文献中并未记述疫苗的层析纯化、生产的详细内容。1. J.-H. Tian et al., SARS-CoV-2 spike glycoprotein vaccine candidate NVX-CoV2373 immunogenicity in baboons and protection in mice, Nature Communications (2021)12:372, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20653-82. Q.-D. Su et al., Recombinant SARS-CoV-2 RBD with a built in T helper epitope induces strong neutralization antibody response, Vaccine, 39, (2021) 1241-1247, https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2021.01.0443. L. Dai et al., A Universal Design of Betacoronavirus Vaccines against COVID-19, MERS, and SARS, Cell. 2020 Aug 6; 182(3): 722–733.e11.,  doi: 10.1016/j.cell.2020.06.035, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7321023/4. W.-H. Chen et al, Optimization of the production process and the characterization of yeast-expressed SARS-CoV recombinant receptor-binding domain (RBD219-N1), a SARS vaccine candidate, J. Pharmaceutical Sciences, 106 (2017) 1961-1970, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0022354917302733?via%3Dihub5. W.-H. Chen et al., Yeast-expressed recombinant protein of the receptor-binding domain in SARS-CoV spike protein with deglycosylated forms as a SARS vaccine candidate, Human Vaccine & Immunotherapeutics10:3 648-658 (2014), https://dx.doi.org/10.4161/hv.274646. European Medicines Agency Assessment report, Covid-19 vaccine, AstraZeneca, EMA/94907/2021, https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/vaxzevria-previously-covid-19-vaccine-astrazeneca-epar-public-assessment-report_en.pdf7. European Medicines Agency Assessment report, Covid-19 vaccine, Covid-19 Vaccine Janssen, EMA/158424/2021, https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/covid-19-vaccine-janssen-epar-public-assessment-report_en.pdf8. China Patent CN111218459B (2020); Recombinant novel coronavirus vaccine taking human replication defective adenovirus as carrier, Claim 14. The method of claim 9, wherein the purification method of step (6) is Source 30Q chromatography.https://www.incopat.com/detail/init2?formerQuery=3eQEo0gaDTgd8BXMtGFAiWr4kAd0KKkg&local=en9. Sputnik V Press release, April 28, 2021, It uses a 4-stage purification technology that includes two stages of chromatography and two stages of tangential flow filtration.https://sputnikvaccine.com/newsroom/pressreleases/sputnik-v-statement-on-brazilian-health-regulator-anvisa-s-decision-to-postpone-authorization/10. Pharmar's Almanac, April 23, 2020 PAO-M04-20-CL-002, Preliminary scalable downstream processes have been designed, includingconcentration and buffer exchange of clarified extract capture and polishing chromatography.https://www.pharmasalmanac.com/articles/applying-rapid-countermeasure-preparedness-to-development-of-a-novel-covid-19-vaccine11. Q. Gao et al., Rapid development of an inactivated vaccine for SARS-CoV-2, Science, 03 Jul. 2020: Vol. 369, Issue 6499, pp. 77-81,DOI: 10.1126/science.abc1932 "12. Wang et al., Cell 182 (2020) 713-721, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7275151/pdf/main.pdf13. Y.-F. Yao et al., Protective Efficacy of Inactivated Vaccine against SARS-CoV-2 Infectionin Mice and Non-Human Primates, Virologica Sinica, (2021), https://doi.org/10.1007/s12250-021-00376-w14. B. Ganneru et al., E valuation of S afety and I mmunogenic ity of an Adjuvanted, TH-1 Ske wed, Whole Virion 1 Inac tiv atedSARS-CoV -2Vaccine, BBV152, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.09.285445v2.full15. E. Qin et al., Vaccine 24 (2006) 1028-1034, Immunogenicity and protective efficacy in monkeys of purified inactivated Vero-cell SARS vaccine, https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2005.06.03816. Z. Kis et al., HOW TO MAKE ENOUGH VACCINE FOR THE WORLD IN ONE YEAR, May 26 (2021),https://mkus3lurbh3lbztg254fzode-wpengine.netdna-ssl.com/wp-content/uploads/mRNA-vaccine-roadmap-May-26-final.pdf17. A. Schmidt et al., Digital twin of mRNA-based SARS-CoV-19 vaccine manufacturing towards autonomous operation for improvements in speed, scale, robustness, flexibility and real-time release testing, Processes 2021, 9, 748. https://doi.org/10.3390/pr905074818. A. B. Vogel et al., BNT162b vaccines protect rhesus macaques from SARS-CoV-2, Nature 592 (2021) 283,https://doi.org/10.1038/s41586-021-03275-y19. K. S. Corbett et al., SARS-Cov-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness, Nature 586 (2020) 567,https://www.nature.com/articles/s41586-020-2622-020. E. Prompetchara et al., DNA vaccine candidate encording SARS-CoV-2 spike proteins elicited potent humoral and Th1 cell-mediated immune response in mice, PLOS ONE, March 22, 2021, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0248007

通过基因重组制备的抗体片段（Fab）等低分子抗体，与完整抗体相比，其分子尺寸更小，具有易扩散、渗透性强，以及不会与Fc受体产生相互作用、副作用小等优点。并且，可以利用大肠杆菌、CHO细胞等获得高浓度、高表达的抗体片段，因此在抗体药物、诊断用药的应用上备受关注。一般来讲，低分子抗体的纯化工艺第一步捕获（Capture）步骤推荐使用Protein L亲和层析（AFC），其后接离子交换层析（IEC）等进行精纯。下面介绍几个以Protein L为配基的亲和填料分离纯化低分子抗体的相关文献。● 抗体的基本结构及分离抗体时使用的亲和层析配基抗体结构结合部位AFC配基目标纯化物H链VH (VH3)Protein AIgG, Fab, F(ab')2, scFv, VH domainCH1Protein GIgG, Fab, minibody抗体片段CH2 (-CH3; Fc)Protein AIgG, Fc fusion proteinProtein GCH3抗体片段Fc; N-glycanFc受体L链VLProtein LFab, F(ab')2, scFv, diabody, minibody, VL domain, dAbCL(Kappa)(Lambda)抗体片段Fab, F(ab')2, scFv, diabody, minibody, dAb（纯化工艺示例）培养上清（Fab)（大肠杆菌、CHO细胞等）（候选填料例）TOYOPEARL AF-rProtein L-650F(TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F)（其他Protein G或抗体特异性AFC填料）TOYOPEARL Sulfate-650FTOYOPEARL GigaCap S-650MTOYOPEARL MX-Trp-650M (MXC)TOYOPEARL NH2-750FTOYOPEARL GigaCap Q-650M（其他疏水层析填料等）预处理（离心等）Protein L亲和层析IEC（阳离子交换层析）IEC (FT; Flow-through)等（阴离子交换层析）● 使用Protein L亲和层析等填料从大肠杆菌、CHO细胞中纯化低分子抗体的相关文献● 从大肠杆菌中分离纯化重组Fab和相关杂质的示例（文献No. 1）（要点）• 确立了大肠杆菌表达的重组低分子抗体(Fab)的纯化方法，并对相关杂质进行了分离和识别（表征）。• 通过使用Protein L亲和层析、Protein G亲和层析及阳离子交换层析的三步层析法（自动化），对4种重组Fab进行纯化，再做质谱分析。• 识别出纯化产物中的Fab异构体、Fab相关杂质的L链（LC）以及L链的低分子片段（LMW）。• 自动化Fab纯化及分析法的确立，让生产菌株及培养条件的优化变得容易。● 使用Protein L亲和层析从大肠杆菌分离纯化重组Fab及相关杂质的示例（出自文献1）使用TOYOPEARL AF-rProtein L-650F，有效分离出目标物质Fab，以及产品相关杂质的L链（LC）和LC低分子片段（LMW）。Ref.: C. Schimek et al., Three-dimensional chromatography for purification and characterization of antibody fragments and related impurities from Escherichia coli crude extracts,J. Chromatography A, available on line November 13, 2020, 461702, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2020.461702● Protein L亲和填料和筛选用预装柱产品一览表货号产品名称粒径（μm）包装**(mL)备注0023486TOYOPEARL AF-rProtein L-650F30 - 6010散装填料（瓶）0045200SkillPak TOYOPEARL AF-rProtein L-650F30 - 601 mL×1支预装柱0045221SkillPak TOYOPEARL AF-rProtein L-650F30 - 601 mL×5支预装柱0045257SkillPak TOYOPEARL AF-rProtein L-650F30 - 605 mL×1支预装柱0045228SkillPak Antibody(TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F, AF-rProtein L-650F, NH2-750F, Sulfate-650F, GigaCap Q-650M, GigaCap S-650S)-1 mL×6种×1支预装柱0045229SkillPak mAb Platform(TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F, NH2-750F, Sulfate-650F)-1 mL×3种×2支预装柱0045232SkillPak Best-in-Class(Ca++Pure-HA*, TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F, AF-rProtein L-650F, NH2-750F, Sulfate-650F)-1 mL×5种×1支预装柱* Ca++Pure-HA是美国制造的产品，受美国相关出口法令管辖。**填料有不同粒径和不同包装规格的产品。SkillPak分为1 mL预装柱（7 mm I.D.×2.5 cm）和5 mL预装柱（8 mm I.D.×10 cm）。【1 mL预装柱】进口：使用“货号0017955 拉紧螺栓型（带包头）”，不可使用“货号0016566 便携式接头·1/16"（PEEK）”。出口：可直接连接内螺纹接头，连接外螺纹接头时需使用管套（“货号0017898 拉紧螺栓型管套”）等配件。【5 mL预装柱】进口和出口：使用“货号0016566 便携式接头·1/16"”或“货号0017955 拉紧螺栓型（带包头）”。

在抗体药物生产的下游工艺中，一般会在捕获阶段（Protein A亲和层析）之后的精制步骤中，采用两种不同分离模式的层析法进行纯化。疏水层析（HIC）是能有效去除多聚体等杂质的分离模式。I. R. A. P. Bresolin, N. Lingg, I. T. L. Bresolin and A. JungbauerHydrophobic interaction chromatography as polishing step enables obtaining ultra-pure recombinant antibodiesJ. Biotechnology: X6 (2020) 100020, https://doi.org/10.1016/j.btecx.2020.100020（要点）·在精制步骤中使用HIC填料TOYOPEARL Phenyl-650M，分离纯化出了超高纯度的抗肿瘤坏死因子抗体（anti-tumor necrosis factor alpha：TNFa、IgG1）。·对HIC模式下的吸附等温线、穿透曲线、层析分离等实施了评估。·通过HIC纯化的抗体的纯度是99.9%，回收率是96.2%。并且确认到，抗体组分中混入的多聚体杂质、宿主细胞蛋白（HCP）、DNA都在检验要求范围之内。·在需要制备超高纯度的抗体时，可在下游纯化工艺中使用该HIC分离法。● 抗肿瘤坏死因子抗体（anti-tumor necrosis factor alpha：TNFa、IgG1）的纯化样品：抗肿瘤坏死因子抗体（anti-tumor necrosis factor alpha：TNFa、IgG1）参照抗体：阿达木单抗 (Adalimumab，商品名：Humira® )动态吸附载量（TOYOPEARL Phenyl-650M）：12.05 g/L色谱柱尺寸：5 mm I.D. × 2.55 cm、驻留时间：2.5 min（流速：0.2 mL/min）洗脱溶液：20 mmol/L磷酸钠缓冲溶液（pH 7.4）＋ 1 mol/L 硫酸铵多聚体的分析、定量：TSKgel® G3000SWXL● 使用疏水填料TOYOPEARL Phenyl-650M对抗体进行超高纯度纯化（分离出的抗体洗脱峰1和洗脱峰2的纯度测定，请继续阅读下一页）●对疏水层析（HIC）纯化后的抗体（Peak 1）进行纯度测定样品浓度(g/L)a抗体纯度(%)b多聚体(%)cHCP(ppm)ddsDNA(ppb)eanti-TNFa IgG1（纯化前）2.0098.041.53342.5＜ 0.41*anti-TNFa IgG1 + salt（添加样品）2.0098.311.55173.7＜ 0.41*Peak 1（纯化组分）0.9699.90＜ 0.06*＜ 2.0*＜ 0.85*Peak 20.0359.8857.55＜ 63*＜ 27*Adalimumab (Humira)2.0099.560.33n.d.(181.6)**＜ 0.41*a by UV at 280 nm, b by SEC at 280 nm, c by SEC at 215 nm, d ELISA, e PCR resDNASEQ®* Below lower limit of detection (LLOD), undiluted sample used** Data from LC/MS/MS by Oliviero et al., Easy, Fast and Reproducible Analysis of Host Cell Protein (HCP) in Monoclonal Antibody Preparations, Application Note (2019)Ref.: I. R. A. P. Bresolin et al., J. Biotechnology: X6 (2020) 100020, https://doi.org/10.1016/j.btecx.2020.100020, data modified from original※通过HIC，获得了比市售抗体药物阿达木单抗更高纯度的抗体组分。● 抗体纯化时HIC填料选择的要点·根据抗体的疏水性，选择疏水性适度的HIC填料（官能团、细孔径、粒径等参数的不同），优化抗体的回收率和分离选择性（去除杂质）·优化分离时的洗脱条件（缓冲液浓度、pH、盐浓度、流速、梯度的倾斜度、温度等）·设置稳定的线性梯度洗脱条件，使抗体在梯度的中间部分洗脱出来·HIC填料的疏水性：（低） Ether-650/PPG-600 （高）● HIC填料和筛选用预装柱产品一览表货号产品名称粒径(mm)规格*(mL)备注0016173TOYOPEARL Ether-650M40 - 90100散装填料（瓶）0021302TOYOPEARL PPG-600M40 - 90100散装填料（瓶）0014478TOYOPEARL Phenyl-650M40 - 90100散装填料（瓶）0021888TOYOPEARL Phenyl-600M40 - 90100散装填料（瓶）0007477TOYOPEARL Butyl-650M40 - 90100散装填料（瓶）0021449TOYOPEARL Butyl-600M40 - 90100散装填料（瓶）0019956TOYOPEARL SuperButyl-550C50 - 150100散装填料（瓶）0019026TOYOPEARL Hexyl-650C50 - 150100散装填料（瓶）0043276TSKgel Ether-5PW (20)15 - 2525散装填料（瓶）0043176TSKgel Ether-5PW (30)20 - 4025散装填料（瓶）0043277TSKgel Phenyl-5PW (20)15 - 2525散装填料（瓶）0043177TSKgel Phenyl-5PW (30)20 - 4025散装填料（瓶）货号产品名称粒径(mm)规格(mL)备注0045220SkillPak TOYOPEARL Ether-650M40 - 901 mL×5支预装柱0045218SkillPak TOYOPEARL PPG-600M40 - 901 mL×5支预装柱0045217SkillPak TOYOPEARL Phenyl-650M40 - 901 mL×5支预装柱0045216SkillPak TOYOPEARL Phenyl-600M40 - 901 mL×5支预装柱0045215SkillPak TOYOPEARL Butyl-650M40 - 901 mL×5支预装柱0045214SkillPak TOYOPEARL Butyl-600M40 - 901 mL×5支预装柱0045219SkillPak TOYOPEARL Hexyl-650C50 - 1501 mL×5支预装柱0045233SkillPak HIC(TOYOPEARL Butyl-650M, Phenyl-650M,PPG-600M, Hexyl-650C, Ether-650M)-1 mL×5种×1支预装柱0045234SkillPak HIC(TOYOPEARL Butyl-600M, Phenyl-600M,PPG-600M, Hexyl-650C, Ether-650M)-1 mL×5种×1支预装柱0045235SkillPak HIC(TOYOPEARL Butyl-650M, Phenyl-650M, PPG-600M)-1 mL×3种×2支预装柱0045236SkillPak HIC(TOYOPEARL Butyl-600M, Phenyl-600M, PPG-600M)-1 mL×3种×2支预装柱0045237SkillPak HIC(TOYOPEARL Phenyl-650M, PPG-600M, Hexyl-650C)-1 mL×3种×2支预装柱0045238SkillPak HIC(TOYOPEARL Phenyl-600M, PPG-600M, Hexyl-650C)-1 mL×3种×2支色谱柱0045256SkillPak TOYOPEARL Ether-650M40 - 905 mL×1支预装柱0045254SkillPak TOYOPEARL PPG-600M40 - 905 mL×1支预装柱0045253SkillPak TOYOPEARL Phenyl-650M40 - 905 mL×1支预装柱0045252SkillPak TOYOPEARL Phenyl-600M40 - 905 mL×1支预装柱0045251SkillPak TOYOPEARL Butyl-650M40 - 905 mL×1支预装柱0045250SkillPak TOYOPEARL Butyl-600M40 - 905 mL×1支预装柱0045255SkillPak TOYOPEARL Hexyl-650C50 - 1505 mL×1支预装柱*不同级别的填料中，有不同粒径和不同包装规格的产品。SkillPak分为1 mL色谱柱（7 mm I.D.×2.5 cm）和5 mL色谱柱（8 mm I.D.×10 cm）。1 mL型号：进口：使用“货号0017955 拉紧螺栓型（带堵头）”，不可使用“货号0016566 便携式接头·1/16"（PEEK）”。出口：可直接连接内螺纹接头，连接外螺纹接头时需使用管套（“货号0017898 拉紧螺栓型管套”）等配件。5 mL型号：进口和出口：使用“货号0016566 便携式接头·1/16"”或“货号0017955 拉紧螺栓型（带包头）”。

SkillPak是一种预装填了TOYOPEARL®、TSKgel® PW系列以及Ca++Pure-HATM羟基磷灰石填料的1 mL及5 mL的预装柱。（库存充足，不存在期货过长的状况。）适用于生物药、重组蛋白等分离纯化时层析工艺中填料的筛选或方法开发/优化亦或是少量简单的纯化制备。SkillPak可以直接连接在HPLC系统或者中低压液相层析系统（如AKTA系统）上使用。● SkillPak的特点・1 mL规格是小体积的简易预装柱（预装柱尺寸：7 mm I.D. x 2.5 cm (1 mL)，8 mm I.D. x 10 cm (5 mL)），可以用于填料的筛选或者纯化条件的初期优化。・5 mL规格的柱高为10 cm，因此柱效较高，适用于纯化条件的详细摸索、优化以及简易的纯化制备。・有适用于抗体纯化、耐盐型离子交换、混合模式、Best in Class等用途不同的多种SkillPak预装柱套装。**用于抗体纯化的套装有两种类型・抗体纯化用・抗体纯化平台用・最大使用流速：1 mL规格为4 mL/min、5 mL规格为5 mL/min（M, C级）；2.5 mL/min（其他粒径）**常用流速1 mL规格：0.2 - 1.0 mL/min5 mL规格：0.5 - 2.0 mL/min・预装柱最大耐压为0.3 MPa（该最大耐压可以适用于大部分中低压层析系统）● 连接HPLC液相系统（1 mL规格）*预装柱尺寸与HiTrap相同，为7mm I.D. x2.5 cm。入口：使用「货号0017955连接头（附筛板；在线过滤器）」连接**（注）「货号0016566手动连接头・”1/16（PEEK）」不可以直接连接出口：雌口可以直接连接；连接雄口需要用到「货号0017898两通接头」等转接部件（5 mL 规格）入口、出口：可使用「货号0016566手动连接头・1/16”（PEEK）」直接连接，或者用「品番0017955连接头（附筛板；在线过滤器）」连接。● SkillPak连接层析系统Cytiva公司（前身为GE Healthcare Lifescience公司）等层析系统可以直接用标准的接口（1/16英寸配管10-32UNF）连接使用。Made in Canada with imported parts.Tosoh Bioscience makes no representation or warranty (including warranty of fitness for a particular purpose and of noninfringement of intellectual property) with regard to these columns.  By use of a column the user is deemed to have determined the column meets all of the user’s requirements.

羟基磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2被加工成高纯度球状颗粒，可作为层析填料使用。由于其结晶的化学结构、立体构造的特点，羟基磷灰石与抗体的Fab片段、Fc片段可发生相互作用。所以至今为止，羟基磷灰石在抗体及蛋白质的纯化、多聚体和残留核酸的去除等工艺中，作为精细纯化步骤的填料被广泛使用。最近，由于其特殊的相互作用（金属螯合、氢键等作用），羟基磷灰石作为阳离子交换型的混合模式填料，被人们重新认识。羟基磷灰石由于在酸性溶液中化学稳定性相对较差，所以使用条件上存在一定的限制。● 羟基磷灰石的主要用途· 分离抗体及蛋白质的多聚体、异构体、分解物以及电荷异质体等目标产品内源性杂质· 分离DNA、HCP、病毒等来自生产工艺、混入的外源性杂质/污染物· 适用于最终（精纯）步骤中的分离纯化● 在酸性条件下，与市售羟基磷灰石耐久性对比在高吸附（高载量；下同）型羟基磷灰石Ca++Pure-HA、市售高吸附型（B公司、Type I）和高耐久型（B公司、Type II；载量较低）羟基磷灰石填料装填的层析柱中，连续用弱酸性蒸馏水通液时，层析柱的理论塔板数的变化如上图所示。市售品在大约80～90小时通液后，理论塔板数下降10%以上。与之相比，Ca++Pure-HA的理论塔板数虽然也会缓慢减少，但在约160小时之前，理论塔板数仍保持在90%以上。也就是说，Ca++Pure-HA属于高吸附型，且在酸性条件下的耐久性更好。另外，在更低的酸性条件（pH 6.5～3.5）下使用和需要酸洗时，可以推荐使用耐盐性阳离子交换填料TOYOPEARL Sulfate-650F和阳离子交换型的混合模式填料TOYOPEARL MX-Trp-650M。● 羟基磷灰石和混合模式填料（包括耐盐性离子交换填料）的性能比较分离模式TOYOPEARL羟基磷灰石耐盐性阴离子交换填料耐盐性阳离子交换填料混合模式产品名称NH2-750FSulfate-650FMX-Trp-650MCa++Pure-HA填料基质亲水性聚合物羟基磷灰石粒径45 μm45 μm75 μm39 μm官能团、配基多胺基硫酸基色氨酸Ca2+, PO43-, OH-官能团、配基密度0.07~0.13 eq/L≥0.53 eq/L--静态吸附载量（SBC：人IgG）≥70 g/L≥114 g/L≥75 g/L≥20 g/L* (55 g/L)出厂溶剂20%乙醇**20%乙醇、0.2 mol/L醋酸钠20%乙醇干燥凝胶（或1 mol/L的NaOH溶液）保存温度室温特点· 即使在盐浓度较高条件下，也具有较高载量· 有较大的细孔径，去除多聚体、病毒、DNA、内毒素的效果更好· 流穿效果好· 多聚体分离效果更好· 即使在盐浓度较高条件下，也具有较高载量· 也可用于肝素类亲和分离· 高吸附载量，分离峰形尖锐，回收率高· 即使在盐浓度较高条件下，也具有较高载量· 二价特异性抗体、scFv的分离效果好· 具有与市售品同等或更高的吸附载量· 填料耐久性也更高· 具有与市售品同等或更高的性能，但价格更便宜（注意）洗脱液使用磷酸钙、氯化钾* 动态吸附量（DBC）：驻留时间是2分钟；驻留时间5分钟时，DBC是55 g/L-gel。** TOYOPEARL NH2-750F需要使用0.1 mol/L HCl清洗，置换对离子后，才能保存在20%乙醇水溶液中。● 羟基磷灰石和混合模式填料（包括耐盐性离子交换填料）的产品一览表货号产品名称粒径（μm）包装规格*备注0045045Ca++Pure-HA3950 g散装填料（瓶）0045053Robocolumn Ca++Pure-HA, 8 × 200 μL39200 μL × 896微孔板专用0045054Robocolumn Ca++Pure-HA, 8 × 600 μL39600 μL × 896微孔板专用0023439TOYOPEARL NH2-750F45250 mL散装填料（瓶）0023443ToyoScreen NH2-750F451 mL × 6预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0023444ToyoScreen NH2-750F455 mL × 6预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0045021RoboColumn NH2-750F45200 μL × 896微孔板专用0045022RoboColumn NH2-750F45600 μL × 896微孔板专用0023468TOYOPEARL Sulfate-650F45250 mL散装填料（瓶）0023472ToyoScreen Sulfate-650F451 mL × 6预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0023473ToyoScreen Sulfate-650F455 mL × 6预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0045027RoboColumn Sulfate-650F45200 μL × 896微孔板专用0045028RoboColumn Sulfate-650F45600 μL × 896微孔板专用0022817TOYOPEARL MX-Trp-650M7525 mL散装填料（瓶）0022824ToyoScreen MX-Trp-650M751 mL × 6预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0022825ToyoScreen MX-Trp-650M755 mL × 6预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0045051RoboColumn MX-Trp-650M75200 μL × 896微孔板专用0045052RoboColumn MX-Trp-650M75600 μL × 896微孔板专用0021400ToyoScreen Holder--柱套、转接头（入口1 mL专用）、（入口5 mL专用）、转接头（出口）各1个、堵头2个* Ca++Pure-HA是干燥粉末品。可提供不同体积包装的产品。 ToyoScreen预装柱可以直接连接HPLC系统。Ca++Pure-HA是美国制造的产品，受美国相关出口法令的限制。

在全球医药品销量排行前100种产品中，生物药物几乎占据了一半。其中，抗体药物预计5年后将占据销量前20种产品中的9种。近年来，为了附加新的药效，将低分子药物连接到抗体上的抗体药物偶联物（ADC）受到了广泛关注。Brentuximab vedotin (2011)、Trastuzumab emtansine (2014)、Gemtuzumab ozogamicin (2017)、Inotuzumab ozogamicin (2017) 等抗体药物偶联物已经获批，并用于实际治疗中。同时还有大约100项ADC正处于研发阶段。在ADC的研发中，每一个抗体上链接的药物个数（DAR: Drug Antibody Ratio）以及控制合适的DAR是非常重要的，在ADC的分析和纯化中常常用到的方法是疏水层析法（HIC）。DAR值在2〜4之间属于最佳比率，但最近也有文献报道DAR在6〜8的ADC药效也很好。参考文献1. O. Jacobson et al., PET-Guided Evaluation and Optimization of Internalized Antibody–Drug Conjugates Targeting Erythropoietin-Producing Hepatoma A2 Receptor, J. NUCLEAR MEDICINE, 58 (2017) 1838-18442. Antibody-Drug Conjugate Mimic Purification with TOYOPEARL PPG-600M HIC Resin for DAR-Separation, Tosoh Bioscience Application Note, 20183. G. D. Haeley et al., A RAGE-Targeted Antibody-Drug Conjugate: Surface Plasmon Resonance as a Platform for Accelerating Effective ADC Design and Development Antibodies, (2019), 8, 7; doi:10.3390/antib8010007货号产品名称粒径（μm）包装规格*备注0016173TOYOPEARL Ether-650M65100 mL散装填料（瓶）0021302TOYOPEARL PPG-600M65100 mL散装填料（瓶）0014478TOYOPEARL Phenyl-650M65100 mL散装填料（瓶）0014477TOYOPEARL Phenyl-650S35100 mL散装填料（瓶）0021888TOYOPEARL Phenyl-600M65100 mL散装填料（瓶）0007477TOYOPEARL Butyl-650M65100 mL散装填料（瓶）0007476TOYOPEARL Butyl-650S35100 mL散装填料（瓶）0021449TOYOPEARL Butyl-600M65100 mL散装填料（瓶）0019956TOYOPEARL SuperButyl-550C100100 mL散装填料（瓶）0019026TOYOPEARL Hexyl-650C100100 mL散装填料（瓶）0021398ToyoScreen HIC-1 mL×6层析柱*、ToyoScreen Holder（柱套必须），PPG-600M, Phenyl-650M, Phenyl-600M, Butyl-650M, Butyl-600M, Hexyl-650C0021399ToyoScreen HIC-5 mL×6层析柱*、ToyoScreen Holder（柱套必须），PPG-600M, Phenyl-650M, Phenyl-600M, Butyl-650M, Butyl-600M, Hexyl-650C,0021400ToyoScreen Holder--柱套、转接头（入口1 mL专用）、（入口5 mL专用）、转接头（出口）各1个、堵头2个0045124MiniChrom PPG-600M655 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm0045121MiniChrom Phenyl-650M655 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm0045122MiniChrom Pheny-650S355 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm0045123MiniChrom Phenyl-600M655 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm0045125MiniChrom Butyl-650M655 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm0045126MiniChrom Butyl-650S355 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm0045127MiniChrom Butyl-600M655 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm0045128MiniChrom SuperButyl-650C1005 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm0045129MiniChrom Hexyl-650C1005 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm* 包括TOYOPEARL Ether-650M在内，还有各级别单品的ToyoScreen系列产品。**微孔板专用层析柱RoboColumn® (200μL x 8, 600μL x 8) 的部分产品也可提供。ToyoScreen和MiniChrom层析柱可以直接连接HPLC系统。

在全球医药品销售额排行的前100种产品中，生物药几乎占据了50%，而且这一比例还将继续扩大。最近，多特异性或多功能性抗体（双特异性抗体、小分子抗体、抗体药物偶联物）的研发也非常活跃。因此，需要有更高纯度、更高效率的纯化技术和纯化方法。在生物制药下游纯化工艺中，常会用到亲和层析（AFC）、离子交换层析（IEC）和疏水层析（HIC）。而从越来越多的应用实例中可以看出，使用综合了这些分离模式特点的混合模式层析（MMC, MXC）填料，不仅能够缩短生物药的纯化工序，还能够确保高纯度纯化，从而提高生产效率、降低生产成本。本资料是介绍东曹公司目前所拥有的多款混合模式专用TOYOPEARL®填料及最近上市的羟基磷灰石填料的应用实例。● 混合模式填料一览表填料官能团分离原理目标纯化物（示例）文献TOYOPEARL NH2-750F伯胺基-NH2（嫁接式键合）· 阴离子交换· 疏水性相互作用血清白蛋白1抗体（单体、多聚体、scFv）2, 3, 4, 5内毒素4病毒6TOYOPEARL Sulfate-650F硫酸基-O-SO3（嫁接式键合）· 阳离子交换· 疏水性相互作用抗体（单体、多聚体）7, 8scFv9抗凝血酶IIITOYOPEARL MX-Trp-650M色氨酸· 阳离子交换· 疏水性相互作用抗体（IgG、双特异性抗体、多聚体）10, 11, 12小分子抗体（scFv, Fab, Fc）10血清蛋白、白蛋白（重组体）13, 14, 15, 16酶17类胰岛素生长因子（IGF-1）18Ca++Pure-HATM羟基磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2· 阳离子交换· 金属配位抗体、多聚体19, 20, 21抗体片段22酶23混合模式填料综述24参考文献1.  N. Yoshimoto et al., Biotechnol. J., 10 (2015) 1-62.  T. Yamasa et al., J. Chromatogr. B, 1061-1062 (2017) 110-1163.  Tosoh Bioscience Chromatography Resin Application Note, AN914.  Tosoh Bioscience TOYOPEARL Application Note, AN945.  Tosoh Bioscience TOYOPEARL Product Overview, PO396.  J. Vajda et al., J. Chromatogr. A, 1448 (2016) 73-807.  Tosoh Bioscience TOYOPEARL Application Note, AN988.  Tosoh Bioscience TOYOPEARL Product Overview PO459.  N. Walch et al., Biotechnol. J., 12 (2017) 170008210.  E. Muller et al., HIC & RPC Conference (2013)11.  J. Vadja et al., Biotechnol. J., 9 (2014) 555-56512.  J. Vadja et al., Bioprocess Int. 16 (10) (2018) 59-62　  　（Novimmune, US Patent, 2016/0264685 A1）13.  L. Breen et al., Blood Transfus., 10 (2012) S89-S10014.  Q. Wu et al., J. Chromatogr. A, 1431 (2016) 145-15315.  W. N. Chu et al., Biochem. Bioeng. J. 131 (2018) 47-5716.  W. N. Chu et al., Ind. Eng. Chem. Res. 58 (2019) 3238-324817.  C. U. Chan et al., FEBS Letter, 589 (2015) 3107-3111218.  T. Arakawa．Current Protein & Peptide Science, 20 (2019) 61-6419.  A. Grabski et al., Engineering Conference International  (2015)20.  Tosoh Bioscience Product Overview PO4721.  Tosoh Bioscience Chromatography Resin Application Note AN10722.  Tosoh Bioscience Chromatography Resin Application Note AN8523.  M. D. Youngblutt et al., J. Biol. Chem., 291 (2016) 9190-920224.  V. Halan et al., Current Protein & Peptide Science, 20 (2019) 4-13● 混合模式的TOYOPEARL®和羟基磷灰石填料的主要特点・ 独特的选择性：　综合了离子性、疏水性、亲和相互作用・ 高分辨率　　：　可分离多聚体、异构体，可分离并去除杂质（病毒、宿主细胞蛋白等）・ 高吸附载量　：　可提高生产效率、降低生产成本・ 耐盐性　　　：　在离子强度较高的样品溶液中也可以充分吸附、分离・ 机械强度好　：　可用于高流速、以及使用大型层析制备柱完成分离纯化工作● 混合模式的TOYOPEARL®和羟基磷灰石填料的主要规格参数和特点分离模式TOYOPEARL®羟基磷灰石耐盐性阴离子交换填料耐盐性阳离子交换填料混合模式产品名称NH2-750FSulfate-650FMX-Trp-650MCa++Pure-HATM填料基质亲水性聚合物羟基磷灰石粒径45 μm45 μm65 μm39 μm官能团、配基多胺基硫酸基色氨酸Ca2+, PO43-, OH官能团、配基密度0.07～0.13 eq/L≥ 0.53 eq/L--静态吸附载量（SBC：人 IgG）≥ 70 g/L≥ 114 g/L≥ 75 g/L≥ 20 g/L*出厂溶剂20%乙醇**20%乙醇、0.2 mol/L 醋酸钠20%乙醇干燥粉末（或1 mol/L的NaOH溶液）保存温度室温特点· 即使在盐浓度较高条件下，也具有较高载量· 孔径较大，去除多聚体、病毒、DNA、内毒素的效果更好· 流穿效果好· 多聚体分离效果更好· 即使在盐浓度较高条件下，也具有较高载量· 也可用于类似肝素亲和填料的分离· 高吸附载量、分离峰形尖锐、回收率高· 即使在盐浓度较高条件下，也具有较高载量· 双特异性抗体、scFv的分离效果好· 具有与市售品同等或更高的吸附载量· 填料耐久性也更高· 具有与市售品同等或更高的性能，但性价比更高注意：洗脱液使用磷酸钙、氯化钾* 动态吸附载量（DBC）：驻留时间是2分钟；驻留时间5分钟时，DBC是55 g/L-gel。** TOYOPEARL NH2-750F需要使用醋酸（pH 4）清洗，置换离子对后，才能保存在20%乙醇水溶液中。• 混合模式填料和层析工艺筛选、方法优化用预装柱产品一览表货号产品名称粒径（μm）包装规格*备注0023439TOYOPEARL NH2-750F45250 mL散装填料（瓶）0023443ToyoScreen NH2-750F451 mL×6预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0023444ToyoScreen NH2-750F455 mL×6预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0045209SkillPak™ TOYOPEARL NH2-750F451 mL层析柱，7 mm I.D.×2.5 cm0045245SkillPak™ TOYOPEARL NH2-750F455 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm0045021RoboColumn NH2-750F45200 μL×896微孔板专用0045022RoboColumn NH2-750F45600 μL×896微孔板专用0023468TOYOPEARL Sulfate-650F45250 mL散装填料（瓶）0023472ToyoScreen Sulfate-650F451 mL×6预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0023473ToyoScreen Sulfate-650F455 mL×6预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0045205SkillPak™ TOYOPEARL Sulfate-650F451 mL层析柱，7 mm I.D.×2.5 cm0045241SkillPak™ TOYOPEARL Sulfate-650F455 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm0045027RoboColumn Sulfate-650F45200 μL×896微孔板专用0045028RoboColumn Sulfate-650F45600 μL×896微孔板专用0045230SkillPak™ Salt Tolerant 1 mL Column LibraryContents include:TOYOPEARL Sulfate-650F × 3TOYOPEARL NH2-750F × 3451 mL/支层析柱，7 mm I.D.×2.5 cm/支0045264SkillPak™ Salt Tolerant 5 mL Column LibraryContents include:TOYOPEARL Sulfate-650F × 3TOYOPEARL NH2-750F × 3455 mL/支层析柱，8 mm I.D.×10 cm/支0022817TOYOPEARL MX-Trp-650M4525 mL散装填料（瓶）0022818TOYOPEARL MX-Trp-650M45100 mL散装填料（瓶）0022824ToyoScreen MX-Trp-650M451 mL×6预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0022825ToyoScreen MX-Trp-650M455 mL×6预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0045224SkillPak™ TOYOPEARL MX-Trp-650M451 mL层析柱，7 mm I.D.×2.5 cm0045261SkillPak™ TOYOPEARL MX-Trp-650M455 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm0045051RoboColumn MX-Trp-650M45200 μL×896微孔板专用0045052RoboColumn MX-Trp-650M45600 μL×896微孔板专用0021400ToyoScreen Holder--柱套，转接头（入口1 mL专用）、（入口5 mL专用）转接头（出口）各1个、堵头2个0045045Ca++Pure-HA, 50 g3950 g散装填料（瓶）0045039Ca++Pure-HA, 100 g39100 g散装填料（瓶）0045040Ca++Pure-HA, 250 g39250 g散装填料（瓶）0045225SkillPak™ Ca++Pure-HA391 mL层析柱，7 mm I.D.×2.5 cm0045262SkillPak™ Ca++Pure-HA395 mL层析柱，8 mm I.D.×10 cm0045053RoboColumn Ca++Pure-HA39200 μL×896微孔板专用0045054RoboColumn Ca++Pure-HA39600 μL×896微孔板专用0045231SkillPak™ Mixed Mode 1 mL Column LibraryContents include:Ca++Pure-HA × 3TOYOPEARL MX-Trp-650M × 3-1 mL/支层析柱，7 mm I.D.×2.5 cm/支0045265SkillPak™ Mixed Mode 5 mL Column LibraryContents include:Ca++Pure-HA × 3TOYOPEARL MX-Trp-650M × 3-5 mL/支层析柱，8 mm I.D.×10 cm/支* 如需购买500 mL(g)以上容量的产品，请咨询我公司销售人员或代理商。ToyoScreen®和SkillPakTM预装层析柱可以直接连接通用HPLC系统或AKTA等层析系统。

全球医药品销售额排行前100种产品中，生物药占据了50%，而抗体药更是在销售额排行的前20种药品中占了9种。近年来，医药界正在研发小分子抗体，这种抗体不但保持了抗体的高度特异性，其分子量还小于完整的抗体。小分子抗体有许多种类，除了抗体片段（Fab）以外，在利用基因工程技术制备的人工抗体中，还有单链抗体（scFv）、串联单链抗体（tandem scFv）、更为单纯的双链抗体(diabody)等。 这些小分子抗体不含有Fc片段，所以无法用Protein A填料进行亲和纯化。因此，使用与Fab片段的Kappa轻链（kappa Light chain）结合的Protein L填料，能够有效进行亲和纯化。TOYOPEARL AF-rProtein L-650F具有抗体吸附载量高，耐碱性优异的特点。可用0.1 mol/L NaOH溶液清洗，所以与传统的Protein L填料相比，更有利于提高生产能力和降低生产成本。 ● 高载量型TOYOPEARL AF-rProtein L-650F的产品特性 参数规格粒径 (μm)30 – 60配体重组Protein L (由大肠杆菌表达）配体固定化多点结合IgG吸附载量 (静态)       ＞64 g/L微生物量菌体数 (CFU/mL)   ＜100内毒素 (EU/mL) ＜10异物＜6溶出物＜0.2 % ● TOYOPEARL AF-rProtein L-650F的优势・高吸附载量 ：是市售Protein L填料载量的约1.5倍・提高耐碱性 ：可用0.1 mol/L NaOH清洗，可重复使用・低配体脱落量 ：Protein L配基为多点结合，填料配基脱落率较低・高速分离、处理 ：填料骨架刚性强，所以可用大口径柱进行高流速分离（驻留时间约为2-3分钟）・提高生产能力 ：高载量、耐碱性，可在生产中降低填料的成本・稳定提供 ：可确保稳定提供超过10 L的大量填料・筛选用预装柱 ：提供1 mL和5 mL预装柱，用于工艺开发 ● 使用Protein L填料纯化抗体分离单链抗体（scFv）和tandem scFv的分离条件举例：吸附溶液：0.02-0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲溶液 (pH 6.5)淋洗：scFv、tandem scFv（CHO细胞培养液）：含有0.25-1 mol/L精氨酸和5-10 %异丙醇的吸附溶液scFv（大肠杆菌的包涵体）：含有2 mol/L盐酸胍的吸附溶液*洗脱：0.1 mol/L 柠檬酸或甘氨酸/HCl (pH 2.0-pH 3.0)清洗：酸性溶液 pH 2.0-pH 2.2CIP：   0.05–0.1 mol/L NaOH，接触时间为10–15分钟（限定使用浓度不超过0.1 mol/L NaOH水溶液）（用0.1 mol/L NaOH水溶液浸泡9小时后，吸附量仍维持 90 %）10–20 %乙醇和异丙醇也可有效去除疏水性杂质* Reference：Tosoh Bioscience LLC Application Note, Capture of a scFv from E.coli using TOYOPEARL® AF-rProtein L-650F ● 使用TOYOPEARL AF-rProtein L-650F纯化 CHO细胞培养液中tandem scFv抗体，对其吸附载量和淋洗的效果 样品载量(mg)吸附中间清洗液pH 中间清洗液 洗脱液pH回收率(%)单体(相对%)聚集体(相对%)抗体片段(相对%) HCP (ppm) DNA (ppm)脱落的Protein L(ppm)*Feed----24.663.212.314,782,0682,676-56.5-2.8586.994.55.10.47,3417LOD56.5+ 0.25 M Arg2.8585.593.46.10.56,8722LOD56.5+ 0.25 M Arg+ 5% iPrOH2.8585.493.95.70.46,0161LOD206.5-2.8583.483.416.10.410,5223LOD206.5+ 0.25 M Arg2.8590.180.818.70.48,3682LOD206.5+ 0.25 M Arg+ 5% iPrOH2.8590.182.916.80.46,9661LODBuffer; 0.1 mol/L sodium citrate buffer (pH 6.5)  LOD; Limit of detectionColumn size; 1 mL ※使用添加精氨酸（Arg）和异丙醇（iPrOH）的溶液进行淋洗，有效去除了HCP、DNA等杂质。  ● Protein L纯化后的层析步骤在Protein L填料纯化后的下一个步骤中使用以下其他模式的填料，能够进一步有效去除杂质。・离子交换填料 ：TOYOPEARL NH2-750F、Sulfate-650F（耐盐性离子交换填料）・疏水填料 ：TOYOPEARL PPG-600M、Phenyl-600/650M、Butyl-600/650M、Hexyl-650C・混合模式填料 ：TOYOPEARL MX-Trp-650M  ● Protein L填料和筛选用预装柱产品一览表   货号产品名称吸附载量（g/L）包装规格备注0023486TOYOPEARL AF-rProtein L-650F≥ 6410 mL填料（瓶）0023487TOYOPEARL AF-rProtein L-650F≥ 6425 mL填料（瓶）0023488TOYOPEARL AF-rProtein L-650F≥ 64100 mL填料（瓶）0023494ToyoScreen AF-rProtein L-650F-1 mLX 5预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0023495ToyoScreen AF-rProtein L-650F-5 mLX 1预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0023496ToyoScreen AF-rProtein L-650F-5 mLX 1预装柱，需要使用ToyoScreen Holder（柱套）0045162MiniChrom AF-rProtein L-650F-5 mL预装柱，8 mm I.D. x 10 cm0045065RoboColumn AF-rProtein L-650F-200 uL X 898微孔板专用0045066RoboColumn AF-rProtein L-650F-600 uL X 898微孔板专用0021400ToyoScreen Holder--柱套，转接头（入口1 mL专用），（入口5 mL专用），转接头（出口）各1个，堵头2个 ※ 如需购买Protein L填料的配基脱落检测套装，请咨询我公司销售人员或代理。※ 纯化完整的抗体，请使用高载量、耐碱型的TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F填料 。

抗体药物纯化工艺中最关键的第一步使用Protein A填料进行亲和分离。通过这一步，抗体纯度可达到95%左右。但作为抗体药物，纯度还远远不够，需要进行进一步纯化。主要杂质包括多聚体、抗体片段，来自宿主细胞的蛋白质（HCP）和DNA、病毒、以及自Protein A填料脱落下来的Protein A配基。这些杂质可以通过阴离子交换填料和阳离子交换填料（或混合模式填料）或疏水填料去除。除此之外，往往也会使用阳离子交换填料通过吸附、洗脱模式来进行抗体的纯化。TOYOPEARL Sulfate-650F是一款具有硫酸根官能团的耐盐型阳离子交换填料。对抗体的吸附载量高，可以有效地去除多聚体，宿主细胞蛋白以及脱落的Protein A配基。 l 高载量・耐盐型阳离子交换填料Toyopearl Sulfate-650F的产品特性・ 是一款具有耐盐性的（salt-tolerant）阳离子交换填料，在较高的盐浓度下对抗体也有较高的载量。・ 填料的孔径大，可以有效去除抗体的多聚体、宿主细胞蛋白（HCP）以及其他杂质。・ 具有很好的耐碱性，可以使用0.1 mol/L或者0.5 mol/L NaOH溶液重复对填料进行清洗和再生。・ 可以有效地去除病毒。・ 为了方便初期的填料筛选，配备了专门的ToyoScreen®（1 mL， 5 mL）, MiniChrom® （5 mL）预装柱。 l 使用吸附、洗脱模式纯化抗体分离条件：                                                 层析柱：Toyopearl Sulfate, 6.6 mmI.D.× 3.0 cm (1.0mL)缓冲液：吸附 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 0.1 mol/L NaCl洗脱 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 0.26 mol/L NaCl洗脱 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 0.29 mol/L NaCl洗脱 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 0.32 mol/L NaCl清洗 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 1.0 mol/L NaCl碱清洗 0.5 mol/L NaOH流速   ：45 cm/hr （4分钟保留时间）检测   ：UV (280 nm)温度   ：室温样品   ：通过Protein A层析后收集的单抗（19.1 g/L）   纯化后的杂质含量Protein A纯化后Sulfate-650F纯化后样品负荷量（mg/mL填料）48101单体回收率（%）n/a83二聚体（%）3.902.40多聚体（%）0.540.07HCP（ppm）1,260134Protein A配基（ppm）1.200.04* Protein A纯化步骤均使用Toyopearl AF-rProtein A HC-650F。※大量的样品进行上样（100 mg/mL充塡剤）、用盐浓度为0.26 mol/L 的NaCl进行洗脱。纯化结果，单体的回收率为83%，多聚体、HCP、脱落的Protein A配基等杂质均被有效地去除。参考資料： Application Note; Increase monoclonal antibody purity with TOYOPEARL Sulfate-650F resin; Strong cation-exchange resin for capture and removal of mAb Aggregates, Tosoh Bioscience LLC (2016).l 使用Protein A填料的抗体纯化的层析工艺案例 *使用流穿模式（FT）的情况下，根据抗体的种类来优化填料的粒径以及缓冲液的盐浓度，一般来说推荐使用160mM以上的盐浓度。Protein A填料 ： TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F阳离子交换填料 ： TOYOPEARL Sulfate-650F, GigaCap S-650M, GigaCap CM-650M ： TOYOPEARL MX-Trp-650M（阳离子交换型混合模式填料）阴离子交换填料 ： TOYOPEARL NH2-750F, GigaCap Q-650M, GigaCap DEAE-650M疏水填料            ： TOYOPEARL Butyl-650/600M, Phenyl-650/600M, PPG-600M, Hexyl-650C l TOYOPEARL Sulfate-650F产品参数项目规格官能团硫酸根离子交换容量（meq./L）≥0.53粒径（μm）30-60静态吸附载量（IgG./L）≥114菌体数（CFU/mL）≤100内毒素（EU/mL）≤10异物≤6溶出物≤0.2% l TOYOPEARL NH2-750F填料以及筛选用预装柱产品一览表货号产品名离子交换容量（eq/L）吸附载量（g/L）粒径(μm)包装(mL)备注0023468TOYOPEARL Sulfate-650F0.07-0.13≧ 7030-60250散装填料0023472TOYOPEARL Sulfate-650F0.07-0.13≧ 7030-601 mL × 6筛选用预装柱；需要同时使用ToyoScreen Holder（柱套）0023473TOYOPEARL Sulfate-650F0.07-0.13≧ 7030-605 mL × 6筛选用预装柱；需要同时使用ToyoScreen Holder（柱套）0045117MiniChrom Sulfate-650F0.07-0.13≧ 7030-605 mL预装柱：8 mm ID × 10 cm0021400ToyoScreen Holder----预装柱配套用柱套

抗体药物纯化工艺中最关键的第一步使用Protein A填料进行亲和分离。通过这一步，抗体纯度可达到95%左右。但作为抗体药物，纯度还远远不够，需要进行进一步纯化。主要杂质包含多聚体、抗体片段，来自宿主细胞的蛋白质（HCP）和DNA、病毒、以及自Protein A填料脱落下来的Protein A配基。 这些杂质可以通过阴离子交换填料和阳离子交换填料（或混合模式填料）或疏水填料去除。最近，抗体纯化工艺中流穿模式（FT；原理：目标抗体单体流穿，多聚体以及其他杂质吸附）正在成为主流。其中，Toyopearl NH2-750F填料能够在流穿模式下有效去除多聚体，病毒以及内毒素等杂质。高载量・耐盐型阴离子交换填料Toyopearl NH2-750F的产品特性l 流穿模式纯化抗体（1）纯化条件层析柱：TOYOPEARL NH2-750F，6.6 mm ID×5.85 cm(2.0 mL)流动相：10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0), 0.25 mol/L NaClCIP; 0.5 mol/L NaOH 溶液（洗脱多聚体以及其他杂质）流 速：300 cm/hr检 测：UV（280 nm）温 度：室温样 品：酸处理后的单抗（1 mg/mL）※ 流穿条件：10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0），0.25 mol/L NaCl，多聚体从28%降低到0%。（回收率75%）l 流穿模式纯化抗体（2）TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F填料纯化后收集的组分，在第二步使用TOYOPEARL NH2-750F填料，通过流穿模式有效去除了多聚体、HCP、DNA和脱落Protein A配基等杂质。MCC Process条件单体回收率(%)多聚体(%)*HCPLog Red.DNA(pg/mg)Protein A(ppm)TOYOPEARL NH2-750F（流穿模式）Starting material **N/A3.11.70.3条件A952.62.3not detected***条件B881.02.5not detected**** Aggregate determined according to Bond et al.** Starting material; TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F填料纯化后收集的组分。*** Less than the lower limit of quantification using resDNASEQ Quantitative CHO DNA Kit (Life Tech).参考文献：Multi-Column Continuous Chromatography for Protein A Capture and Orthogonal Polishing of Monoclonal Antibodies, A. Grabski et al., PREP 2016, Poster, presentation data.l TOYOPEARL NH2-750F的优势l 填料孔径大，可以有效去除多聚体、内毒素、病毒等大分子杂质。l 耐碱性优秀，可用0.1-0.5N NaOH溶液进行清洗，并且可重复使用。l 病毒去除效果：以Log reduction表示，降低4～6个数量级。l 作为耐盐型（salt-tolerant）离子交换填料，即使样品溶液中的盐浓度高，也可以实现高载量吸附。l 具备1 mL和5 mL规格的填料筛选用预装柱。l 我司还拥有TOYOPEARL Sulfate-650F，TOYOPEARL Hexyl-650C和 TOYOPEARL MX-Trp-650M 等优秀的抗体纯化用填料，可实现更高纯度的抗体纯化效果。l TOYOPEARL NH2-750F的产品特性项目规格官能团一级氨基离子交换容量 (meq./L)0.07 – 0.13粒径 (um)30 – 60静态吸附载量 (IgG, g/L)≧ 70菌体数 (CFU/mL)≦ 100内毒素 (EU/mL)≦10异物≦ 6溶出物≦ 0.2 %流穿模式纯化条件（例）流动相：10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0-8.0）流动相盐浓度：0 - 500 mmol/L NaCl抗体上样量参考值：50 g/L-gel※根据抗体的不同性质，需要适当调节或优化pH和盐浓度。l TOYOPEARL NH2-750F填料以及筛选用预装柱产品一览表货号产品名离子交换容量（eq/L）吸附载量（g/L）粒径(μm)包装(mL)备注0023439TOYOPEARL NH2-750F0.07-0.13≧ 7030-60250散装填料0023443ToyoScreen NH2-750F0.07-0.13≧ 7030-601 mL × 6筛选用预装柱；需要同时使用ToyoScreen Holder（柱套）0023444ToyoScreen NH2-750F0.07-0.13≧ 7030-605 mL × 6筛选用预装柱；需要同时使用ToyoScreen Holder（柱套）0045108MiniChrom NH2-750F0.07-0.13≧ 7030-605 mL预装柱：8 mm ID × 10 cm0021400ToyoScreen Holder----预装柱配套用柱套l TOYOPEARL NH2-750F填料去除多聚体相关论文和海报1) Salt tolerant chromatography provides salt tolerance and a better selectivity for protein monomer separations, N. Yoshimoto et al., Biotechnol. J., 10 (2015) 1.2) Multi-Column Continuous Chromatography for Protein A Capture and Orthogonal Polishing of Monoclonal Antibodies, A. Grabski et al., PREP 2016, Poster presentation.3) IgG Purification, Better, Faster, Cheaper, P. Gagnon et al., Bioprocess Inernational Conference, 2016, Poster presentation.4) Purification of monoclonal antibodyies entirely flow-through mode, T. Yamada et al., J. Chromatogr., B 1061-1062 (2017) 110-116.

世界医药品销量前100种药物中，生物药物占据50%的销售额。其中销量前20种药物中，9种为抗体药物。尽管如此，抗体药物的制备成本仍是不容忽视的一大问题（估计约$ 200/g ），为了满足市场需求需要进一步降低生产成本。抗体纯化工艺中最受期待的成本降低方法就是提高Protein A亲和填料的载量。通过增加填料的载量，可减少亲和填料的使用量、节约试剂和洗脱溶液、缩短时间，从而有效降低生产成本。所以，在成本削减方面被认为是最重要的一步。        本公司TOYOPEARL AF-rPotein A HC-650F具有非常高的抗体吸附载量和优异的耐碱性，即使用0.1 N-0.2 N NaOH溶液来进行CIP清洗，也可反复使用200个批次以上，因此可以大大降低抗体药物的生产成本。高载量・耐碱性Protein A 填料的特征1. 高载量型TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F 的产品特性粒径30 – 60 micron（＞ 80%）配基重组Protein A（E.coli）配基固定化方法多点键合IgG吸附载量（静态）68 g/L以上（动态吸附载量：65 g/L以上、柱留时间为5 min时）保存溶液**20 % ethanol其他COA                                                         有Protein  A  ELISA kit                                  Cygnus动物来源成分                                        无可用2 % 苯甲醇保存（*苯甲醇的保存方法已有相关专利，使用前请充分确认知识产权的问题。） 2. TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F的优势・抗体吸附载量高，最高载量可达100 g/L。・耐碱性优秀，可用0.1-0.2 N NaOH溶液进行CIP清洗，可反复使用200个批次以上。・由于配基Protein A和基质之间是多点键合，所以配基脱落少。・15 cm柱高的大型层析柱上可实现高流速操作（柱留时间约3分钟）。・提高抗体的生产效率，降低生产成本。・满足客户的大量需求，即使是100 L以上的使用量，也可以迅速稳定提供。・具备1 mL和5 mL规格的筛选用预装柱。・我司同时拥有其他模式的抗体纯化用填料，可对应亲和层析后续的纯化步骤，全方面满足客户高纯度纯化层析工艺中填料的需求。  3. 不同尺寸层析柱和抗体纯化量的对应参考表 抗体上样量 (g)**动态吸附载量 (g/L)内径 (cm)柱高 (cm)柱床体积(mL)装填所需填料体积(mL)* 40 50 60 70 800.810550.160.200.240.280.321108100.250.310.380.440.5011512150.380.470.570.660.7521547591.51.92.32.63.051529436891214161910151,1781,472384757667520154,7105,888151188226264301401518,84023,5506037549041,0551,206601542,39052,9881,3561,6962,0352,3742,713801575,36094,2002,4123,0143,6174,2204,82310015117,750147,1883,7684,7105,6526,5947,536*  装填所需填料体积的计算：1 cm以上内径的层析柱是按照压缩比（CF：1.25）计算而得出的。** 抗体上样量的计算：动态吸附载量 × 柱床体积 × 80 ％***大型层析柱柱高设置：能够实现线性流速约300 cm/hr （柱留时间3分钟）的高度；推荐柱高15 cm。   l Protein A亲和层析工艺后收获组分中的多聚体、抗体片段、HCP、DNA等杂质可利用下面推荐的其他模式填料进一步去除。・离子交换填料：TOYOPEARL NH2-750F, Sulfate-650F（耐盐性离子交换填料）, GigaCap Q-650M, SuperQ-650M・疏水填料：TOYOPEARL PPG-600M, Phenyl-600/650M, Butyl-650/600M, Hexyl-650C・混合模式填料：TOYOPEARL MX-Trp-650M l 脱落Protein A配基检测用试剂盒Cygnus 公司产品货号为 F910 Tosoh R40 and R28 Protein A, Mix-N-Go ELISA （中国代理：北京西美杰科技有限公司，西美杰热线：400-050-4006） l Protein A填料和筛选用预装柱产品一览表 货号产品名吸附载量（IgG）包装备注0023425TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F68 g/L 以上10 mL0023426TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F68 g/L 以上25 mL0023427TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F68 g/L 以上100 mL0023430ToyoScreen AF-rProtein A HC-650F68 g/L 以上1 mL x 5本筛选用预装柱*0023431ToyoScreen AF-rProtein A HC-650F68 g/L 以上5 mL x 1本筛选用预装柱*0023432ToyoScreen AF-rProtein A HC-650F68 g/L 以上5 mL x 5本筛选用预装柱*0021400ToyoScreen Holder-预装柱柱套0045161MiniChrom® TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F68 g/L 以上筛选用预装柱*使用ToyoScreen预装柱，同时需要配套使用ToyoScreen Holder（柱套）。

抗体药作用的基本原理点击上方蓝字关注我们随着现代生物技术的快速发展，抗体药物逐渐成为肿瘤治疗的首选方案。抗体，也称免疫球蛋白（Ig），是一种能特异性结合抗原的糖蛋白，人体内表达的Ig主要有5种：IgM、IgA、IgD、IgG和IgE，其中IgG含量最多。从抗体作用机制来讲，抗体由抗原结合部位（Fab）和可结晶部分（Fc）构成。Fab段可以与特定的抗原结合，由此决定抗原的特异性和亲和力。Fc段可以与免疫细胞表面表达的Fc受体（FcγRI，FcγRII，FcγRIII）、血液中的补体和FcRn结合，从而激活免疫效应，清除外来物质。Fc段决定抗体的效应功能，包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP），以及补体依赖的细胞毒性作用（CDC）。ADCC，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity ），是指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞（NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等）表面的FcR结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞，是抗肿瘤的治疗性抗体药物发生作用的一种作用重要机制。ADCP，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis），也是用于识别和介导治疗性抗体作用于肿瘤细胞的一种重要机制。CDC，补体依赖的细胞毒性作用（Complement Dependent Cytotoxicity），指的是补体参与的细胞毒作用，即通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物而激活补体经典途径，所形成的攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。目前ADCC/ADCP/CDC作用机制并用来检测、评定、筛选合适的抗体，也成为了抗体药物的关键质量属性（CQA），本表为目前ADCC一般检测方法。

默隆实业默隆实业在新冠病毒治疗、诊断相关的研发医药品/试剂（抗体、疫苗、核酸等中、低分子化合物）中生物分析、分离制备的需求日趋旺盛。其中，对于TSKgel色谱柱、TOYOPEARL/TSKgel填料的咨询、需求也日趋增多。分析色谱柱• TSKgel DNA-NPR, DNA-STAT：DNA/RNA、质粒等核酸• TSKgel UP-SW3000, UP-SW2000：病毒表面抗原（蛋白质）• TSKgel G6000PWXL：新冠病毒颗粒100-200 nm• TSKgel Amide-80：病毒表面抗原（蛋白质）的糖链解析纯化制备填料• TOYOPEARL NH2-750F, GigaCap Q-650M：病毒• TSKgel SuperQ-5PW(20)/(30)以及其他PW散装填料：抗体、核酸• TOYOPEARL疏水填料（如PPG-600M等）：疫苗及病毒的精制• Ca++Pure-HA：疫苗及病毒的精制不同病毒的纯化和分析方法    • 流感病毒• TSKgel G4000SWXL；• TOYOPEARL NH2-750F；• GigaCap Q-650M 。    • 疟疾病毒（疫苗）• TOYOPEARL SuperQ-650M；• CM-650M；• Phenyl-650M；• Butyl-650M。    • HIV（疫苗）• TSKgel G5000PWXL；• TOYOPEARL NH2-750F；• GigaCap Q/S-650M；• AF-Heparin HC-650M。   • SARS（多肽药物）• TSKgel G2000SWXL；• UP-SW2000。   • BCG（疫苗功效）• TOYOPEARL Butyl-650M   • 腺病毒伴随病毒（基因治疗用）以及质粒DNA• TSKgel DNA-STAT；• DNA-NPR；• SP-NPR；• TOYOPEARL NH2-750F； • GigaCap Q-650M/S-650M；• Sulfate-650F；• Butyl-650M,；• Phenyl-650M, ；• Ca++Pure-HA。

（十二）气体过滤器使用时应注意哪些问题？“《指南》中提及“应对气体过滤器的使用寿命以及更换频率进行评估。”“用于直接接触无菌药液或无菌设备表面的气体的过滤器，应在每批或多批次连续生产结束后对其进行完整性测试。对于其他的应用，可以根据风险评估的结果，制定完整性测试的频率。”那么在气体过滤器的使用过程中应该如何来注意上述问题？”药品生产中应重视与药液接触的气体的除菌。这些气体包括呼吸空气、保护氮气、压缩空气和冻干机用气体。气体过滤器必须要在蒸汽灭菌和生产过程中，都能耐受膜前后低压降、高流速并具有完全去除细菌的能力。同时，气体过滤器必须保证截留微生物，阻止细菌通过及空气中的病毒通过，并且在经过反复灭菌之后，依然保持完整。1. 气体过滤器的使用范围药品生产过程中，疏水性气体过滤器的应用广泛，根据不同的工艺要求，对截留能力的要求分为下面 3 个等级：? 滤过气体与最终无菌产品或者相关设备的重要表面相接触的，需要最严格的截留要求。如无菌灌装机的压缩空气过滤，无菌原液储罐的呼吸器和冻干设备或灭菌锅（柜）的真空破除过滤器。针对此类应用的气体过滤器应通过液体微生物挑战实验，其物理完整性检测需要与液体微生物挑战实验关联。? 中等要求为滤过气体不直接与无菌药品的暴露表面接触的，包括很多中间步骤的处理和发酵过程的通气。此类应用的气体过滤器应当通过气溶胶微生物挑战实验，其物理完整性需要与气溶胶微生物挑战实验关联。? 对于只要求降低微生物污染水平的应用，是相对要求极低的。因为通常都与对高效空气过滤器（High Efficiency Particulate Air filter, HEPA）的要求类似，所以这类过滤器一般用分散的油气溶胶进行挑战，建立截留能力，即被接受。2. 气体过滤器的使用周期气体过滤器由于材质原因可承受灭菌能力强，使用寿命相对于液体过滤器要长一些，可根据供应商提供的灭菌时长进行更换周期确定。但有一点要尤为注意，工艺用水储罐使用的空气滤器一般采用电加热套形式，以保证滤器不会受水汽影响堵塞，滤芯长期处于高温状态下，寿命大幅降低。所以要结合供应商提供的证明资料对应使用温度及验证数据，确定气体过滤器的更换周期。3.气体过滤器的重复使用在很多应用中，疏水性气体除菌级过滤器是被重复使用或者称为被长期使用的。过滤器的使用者首先需要参考生产商提供的使用手册，重点考虑过滤器可以耐受的累积灭菌周期和正确的灭菌操作过程，防止因过滤器超限度使用而危害无菌生产过程。使用者不能只根据生产商提供的实验室模式条件下的数据确定过滤器的实际使用期限，需要考虑实际工艺条件的影响。可选择的重复/长期使用的方法如下，特别注意下列方法的风险是逐步增加的，使用者应当根据具体的使用工艺要求进行风险评估和选择：? 平行安装过滤器，当其中一个在使用时，另外一个可进行完整性检测和使用前准备。? 使用冗余过滤器，如，两个过滤器串联连接，并采用定期完整性检测和定期更换相结合的方法。? 定期完整性检测和定期更换，结合使用。? 只在首次灭菌后进行完整性检测。? 只在安装完成后进行完整性检测。? 不检测完整性，只依靠历史数据确定更换周期。4. 气体过滤器的监控及完整性测试同样根据气体过滤器使用的3个不同等级，对于过滤器的周期监控也有相应的不同要求：? 滤过气体与最终无菌产品或者相关设备的重要表面相接触的，需要根据既定的生产周期，按照每次使用后（前后）需确认滤器完整性，以降低当批产品污染风险。? 中等要求为滤过气体不直接与无菌药品的暴露表面接触的，可阶段性检测或者制定灭菌周期，在灭菌后进行完整性检测。? 对于只要求降低微生物污染水平的应用，是相对要求极低的。在既定的更换周期的开始及结束时进行检测，中间时间段可进行评估确认是否需要进行监控。? 若采用水侵入法进行气体过滤器的完整性测试，不会引入醇类等低表面张力溶液和过滤膜使用保持干燥，测试结束后不需要进行额外的处理。若采用醇类等低张溶液进行润湿后使用起泡点或扩散流的方法进行测试，而测试后滤器需要继续使用，则需进行额外的清洁，需评估溶液残留对药品可能带来风险。

自2015年版《中国药典》实施以来，东曹技术中心针对其中部分中药、化药、生物药以及药用辅料进行了HPLC分析方法的开发与优化。我们将实验数据汇总成了TSKgel色谱柱药典应用谱图集，并将在公众号中陆续推送与大家分享。希望能够帮您更快速方便地选择合适的色谱柱！如果您对这本应用谱图集感兴趣，欢迎联系我们索取资料~~抑肽酶（Apotinin）是一种广谱蛋白酶抑制剂，分子量为6511，由16种氨基酸的58个残基组成的碱性多肽。在临床上多用于通过注射给药以减少复杂手术（例如心脏手术和肝脏手术）中的出血。在2015版《中国药典》二部中，使用了分子排阻色谱法对注射用抑肽酶中高分子蛋白进行检测，采用3根串联凝胶色谱柱TSKgel G4000SWXL（7.8 mm×30cm, 8 μm），柱温35℃，流速1.0 mL/min，将高分子蛋白和抑肽酶分离。要求二聚体相对抑肽酶的保留时间为0.9；其分离度大于1.0；抑酞酶主峰的拖尾因子不大于2.5。分析条件色谱柱：TSKgel G4000SWXL（7.8 mm I.D.×30 cm×3，8 μm）流动相：3 mol/L 醋酸溶液流速：1.0 mL/min柱温：35 ℃检测器参数：UV @280 nm进样体积：100 μL分析结果 抑肽酶供试品分离谱图结果讨论保留时间小于抑肽酶主峰的均为高分子蛋白峰，在上述分离条件下二聚体与抑肽酶间的分离度为1.4，抑肽酶主峰的拖尾因子为0.91，均满足药典要求。

“《指南》中提及“除菌过滤器使用后，必须采用适当的方法立即对其完整性进行测试并记录。除菌过滤器使用前，应当进行风险评估来确定是否进行完整性测试，并确定在灭菌前还是灭菌后进行。当进行灭菌后-使用前完整性测试时，需要采取措施保证过滤器下游的无菌性。”本文将对完整性测试的时间选择，考量要素以及失败分析和措施进行详细阐述。”1.完整性测试执行时间和考虑因素如果过滤目的是除菌，则应当对过滤器进行完整性测试。在线测试还是离线测试过滤器由实际工艺需要决定，但应注意，完整性测试是检测整个过滤系统的完整性，而非仅针对过滤器本身，因此进行在线测试能更好的保证上下游连接的完整性。过滤前还是过滤后进行完整性测试的目的不同。完整性测试的时间点不仅取决于实际生产的需要，各国法规对于完整性测试的时间点有着不同的要求。1.1 使用前完整性测试的考虑因素进行使用前的完整性测试时，将滤芯安装在工艺中的滤壳内，若为囊式过滤器则可直接安装在工艺管路上，在线对其进行测试是优先选择。然而也有因工艺要求而需要离线测试的情况。灭菌前完整性测试可证明滤芯已被正确安装了，使用前是完整的。可进行风险评估来确认其适用性。如果在灭菌后进行完整性测试，需要特别留意勿危及无菌性。测试前，应使用流体冲洗过滤器以将其润湿。穿过过滤器的润湿流体应在无菌条件下被收集。在滤芯上游侧加压和测量，被测试的滤芯可作为无菌的屏障。而无菌下游需要收集或无菌排放润湿液体，及连通大气压或下游侧空间应足够大以避免压力上升而影响完整性测试的结果，因此需要采取一定的措施既满足下游对液体和气体的处理，又要保证其无菌性，常见的措施包括：? 连接一个带呼吸器的无菌储罐，用于完整性测试中接收润湿液体和气体的排放。这种措施需要预估无菌储罐的大小，以避免出现重复润湿而储罐体积不够的情况。? 连接一个屏障过滤器，该过滤器由除菌级的疏水和亲水性膜构成，能同时无菌排放润湿液体和测试气体。上述两种方式，都需要对其设施上的辅助过滤器（无菌储罐上的呼吸器，屏障过滤器）进行完整性测试，从而保障系统下游的无菌性。1.2 使用后完整性测试的考虑因素    使用后完整性测试应在过滤后立即进行。液体产品的残留物不应在膜表面干置，如果可能，应将其去除（使用适当的流体进行使用后冲洗）。如果做不到这一点，过滤器应当在诸如冷藏的条件下储存，避免微生物生长。如果过滤器在完整性测试前冷藏过，应让其恢复到室温状态，然后应尽快进行测试。过滤器不应被丢弃直到完成完整性测试，且测试结果被评估。储存条件和期限应被验证以确保不会对过滤器的完整性有负面影响。2.串联过滤的完整性测试该部分已在前文解读中描述，故该处不做赘述。请参见“两个除菌过滤器串联就是冗余过滤吗？”3.失败调查和分析如除菌过滤器通不过完整性测试，有可能是损坏了，但还有其他可能导致失败的原因，包括组装的不正确（密封不严）和润湿不完全等。为了区分过滤器损坏和可能导致失败的测试问题，或是人为因素，应采取以下核实步骤：?选择了合适的完整性测试方法。?使用了正确的测试参数。?使用了正确的润湿流体和润湿程序。?测试系统无泄漏。?过滤组件的温度在测试过程中保持稳定并处于规范内（例如：绝热效应.)。?设备已被正确校准。?测试装置已被正确组装并运行正常。?安装了正确的滤芯。为了证明纠正措施是有作用的，可采取以下重复测试步骤：?根据规范要求重新润湿滤芯，并重复测试。如果滤芯完整性测试再次失败，可使用以下步骤：?应用更强力的润湿条件，增加冲洗的体积/时间，增加压差和（或）应用背压。如果滤芯完整性测试再次失败，可使用以下步骤：?使用低表面张力的参考流体进行完整性测试，以确定滤芯可润湿性变化与滤芯完整性无关。?如果使用参考流体过滤器不能通过测试，则过滤器不能通过测试。如果过滤器在上述失败分析中任何一点通过完整性测试，该滤芯可被视为完整的，能够进行除菌过滤。企业应当建立完整性测试的标准操作程序，如果测试失败，需记录并分析原因，对接下来的故障排除和再次测试的过程和结果都应当有完备的文件记录。下图的完整性测试决策树，可用于评估完整性测试失败。图1：完整性测试故障排除决策树 （PDA TR26）*点击查看高清图过滤器完整性测试失败一个常见的原因是由于滤芯的润湿不充分引起的。润湿不充分可能是由过滤器冲洗不充分，没有浸湿所有的孔，或是过滤器吸附了疏水性的污染物，或是其他配方组分改变了滤膜的表面润湿特性。润湿特性的改变可能会影响完整性测试表现。例如：管道材料可能会进入产品流中，被滤膜吸附，影响了膜的润湿性质，从而导致完整性测试失败。为了获得正确的完整性测试结果，过滤器的多孔结构应被完全润湿，因为完整性测试方法的物理本质依靠的是气体流穿过润湿液体层。滤膜的润湿会受以下因素影响：?膜聚合物：有些聚合物比其他种类容易润湿，依赖于膜材的临界表面张力。?孔的大小：孔越小越难润湿。?润湿流体：某些润湿流体可能与聚合物矩阵有相斥的相互作用。?产品残留或污染物：产品残留物或污染物会改变膜聚合物的亲水性，排斥润湿流体或降低表面引力。?压力条件：应该遵循制造商的压力推荐值以使膜完全润湿。?温度条件：温度影响润湿流体的表面张力。除了上述这些，还可能有与工艺或应用相关、而制造商的使用描述没有涉及的因素影响完整性测试。

自2015年版《中国药典》实施以来，东曹技术中心针对其中部分中药、化药、生物药以及药用辅料进行了HPLC分析方法的开发与优化。我们将实验数据汇总成了TSKgel色谱柱药典应用谱图集，并将在公众号中陆续推送与大家分享。希望能够帮您更快速方便地选择合适的色谱柱！如果您对这本应用谱图集感兴趣，欢迎联系我们索取资料~~布洛芬，是一种苯丙酸类非甾体抗炎药，化学名为2-（4-异丁基）丙酸，是临床使用最普遍的解热镇痛抗炎非处方（OTC）药品，是世界卫生组织、美国FDA共同推荐的儿童退烧药，是公认的儿童优选抗炎药。也被广泛地用于治疗风湿或类风湿疾病，以及关节肌肉痛、头痛、痛经等多种疼痛。本文参照2015年版《中国药典》二部，采用C18色谱柱 TSKgel ODS-100V 对布洛芬缓释胶囊中的布洛芬含量进行分析测定。前处理步骤布洛芬缓释胶囊：取装量差异项下的内容物，混合均匀，精密称取适量(约相当于布洛芬0.1 g )，置于200 mL量瓶中，加100 mL甲醇，振摇30分钟，用超纯水稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。分析条件仪器：Thermo U3000色谱柱：TSKgel ODS-100V (4.6 mmI.D.×250 mm, 5 μm)流动相：醋酸钠缓冲液（称取6.13 g醋酸钠，加水750 mL使溶解，用冰醋酸调节pH值至2.5）+ 乙腈=40+60流速：1.0 mL/min柱温：30°C检测器：紫外检测器（263 nm）进样体积：20 μL分析结果图1  对照品溶液色谱图图2  布洛芬供试品溶液色谱图

TOYOPEARL抗体纯化用层析填料产品精选目录新发布！在这本目录中，我们向您推荐了4款可用于大规模生产的抗体纯化层析填料产品。它们是东曹公司专为单克隆抗体纯化而开发，都具有吸附载量高、杂质去除能力强等特点，堪称Best-in-Class产品。这些优势为工艺开发人员提供了更大的操作灵活性，进而提高生产效率，降低生产成本。兼具高载量与工艺经济性的Protein A填料超强耐碱性的Protein L填料高效捕获并去除mAb多聚体高效清除内毒素和病毒的耐盐型填料

“《指南》中提及“使用前，除菌过滤器必须经过灭菌处理（如在线或离线蒸汽灭菌，辐射灭菌等）。”那么在采用上述各种方法灭菌时需要注意哪些问题呢？”在线或离线蒸汽灭菌时，很多因素造成了过滤系统灭菌的复杂性，例如，塑料组分传热能力较差；滤器上存在的大量的微孔会造成“气体陷阱”；另外蒸汽穿透滤器的路径非常曲折；最终，达到灭菌温度时，过滤器材料可能出现不稳定的情况等。因此采用任何一种灭菌方法都要经过严格的过滤系统灭菌验证。1.灭菌器灭菌常见的灭菌器灭菌对滤器有如下几种包装情形：无论选择哪种包装形式进行灭菌器灭菌, 应保证滤器有完整的屏障既能防止微生物污染又能使蒸汽穿透，从而对过滤器进行彻底灭菌。滤器的进口端和出口端都应能透气，这样在灭菌过程中的不同阶段就不会产生较大压差，使滤器损坏。灭菌过程必须要考虑滤器生产商提供的灭菌相关参数。温度过高可能导致过滤器上的高分子聚合物材质不稳定，并可能影响滤器的物理完整性或者增加可提取物水平。灭菌器灭菌常见问题故障排除如果滤器发生损坏，按照如下表格以查明导致滤器损坏的可能原因。该表列举了在离线灭菌器灭菌（Autoclave）程序中可能遇到的一些问题的可能原因和解决方法。2.在线蒸汽灭菌在线蒸汽灭菌（SIP）是一种对安装在工艺管道中的过滤器、阀门、罐体等组件进行整体灭菌的一种方法。该方法易于重复且易于实现自动化操作，与灭菌器灭菌方法相比，减少了灭菌后各组件进行连接时可能存在的无菌风险，因此广泛地应用于无菌制药生产企业。SIP 系统设计概述图2为用于在线蒸汽灭菌的过滤系统装置的简图。该简图包括滤器、滤器壳体、阀门、压力表和/或温度表。设计 SIP 系统时应注意以下内容：（1）排气理想的排气系统是蒸汽从系统高点进入，而空气从低点排出，如图2所示，因为空气（分子量为29g/mol）重于蒸汽（分子量为18g/mol），所以可自然下沉到低点。如果因实际情况不得不将蒸汽从低点引入系统，其流速也应足够将所有空气排出系统。如果系统中存在一端封闭的盲管（如压力表等），应尽量减短盲管长度至其直径的6倍以下，同时应安装排气口防止蒸汽灭菌过程中空气阻塞在这些部分。（2）排除冷凝水在蒸汽管线上每隔一定距离、阀门上游、通常关闭的阀门处、滤器套筒壳体的上游侧以及任何垂直管道的底部，都应安装排水阀或疏水阀，以便在升温过程中顺利排除冷凝水，以及防止系统冷却过程中对冷凝水的虹吸。水平管道应向下倾斜一定角度（如1:100），防止冷凝水积聚。如果系统的水平管道存在变径，则应保证变径前后底部管道处于同一水平线（如图3所示），以便冷凝水能够顺利排除而不存在“台阶”。（3）热电偶放置将热电偶放置在系统中加热最慢或最冷的点，通常为离蒸汽源最远的排放点。灭菌验证过程中，通过将热电偶完全覆盖整个系统来测定出系统在灭菌过程中温度低的点。SIP 灭菌常见问题及故障排除SIP灭菌经常出现的问题是造成滤芯损坏，如下图4示例：如果滤器发生损坏，检查下表2以查明导致损坏的可能原因。该表列举了在 SIP 灭菌过程中一些问题的可能原因和解决方法。3.辐照灭菌对于除菌过滤应用会用到一次性使用的袋子、软管及所连接的滤器等，可采用辐照灭菌的方式，通常的辐照灭菌工艺采用伽玛射线和电子束灭菌。采用辐照灭菌法灭菌的无菌物品其SAL应辐照灭菌有众多优势，如较高的无菌保证等级，无残留气体或化学的灭菌组分，过滤器保持干燥，减小了包装组份对灭菌过程的干扰等。然而，这种方法也存在一些不足：如一些高分子聚合物材料中的某些组分不适合辐照灭菌，灭菌后的过滤器有效期有限等。已被辐照灭菌过的过滤器、袋子及软管等，由于累积剂量效应的缘故，通常不会采用多次伽马射线灭菌。

通常过滤器变更主要有两种类型：一类是过滤器材质，尺寸，类型及其制造工艺的变更；一类是过滤器供应商的变更。无论何种形式的变更都应对其进行评估以确定其对产品质量的潜在影响（见GMP 第242条），评估应基于对产品工艺的知识和对质量风险管理的方法。过滤器变更评估应由相关领域的专家和有经验的专业人员组成的专家团队进行评估，例如由生产，质量保证，质量控制，研发，药政法规或注册部门的人员组成专家团队评估过滤器变更可能带来的影响。过滤器变更评估应至少评估对产品工艺质量方面的影响和对合规方面的影响，具体评估内容参考如下：对产品工艺质量方面的影响考虑因素可能包括但不限于如下内容：? 过滤性能，如细菌截留能力，过滤批量，对活性物质的吸附能力等? 过滤工艺，如过滤压力，过滤时间，过滤温度，冲洗方式，灭菌方式等? 产品与过滤器的兼容性? 产品的无菌保证? 过滤器的可提取物，浸出物评估? 产品的质量标准? 产品稳定性研究对合规方面的影响考虑因素可能包括但不限于如下内容：? 是否影响注册? 是否影响GMP认证不涉及注册的过滤器变更，企业根据内部已批准的变更管理程序审批即可；对于涉及到注册的过滤器变更，除了需要企业内部审批外，还需要根据药监部门的监管要求进行备案或者审批。对其他方面的影响可能包括但不限于如下内容：? 供应商的变更管理? 物料管理? 文件管理，如原有过滤器验证文件不再适用? 培训系统? 工程改造? EHS影响评估后应根据评估结果制定相应的措施，例如确认过滤器的兼容性实验，重新进行细菌截留能力的确认，或者分析过滤器可提取物，浸出物的实验，以及产品稳定性的研究等等。涉及注册的应与药监部门沟通获得审批或备案后执行变更。变更执行后，应评估变更的执行效果，如在年度质量评审中，收集历史数据以确认过滤器变更的合理性。从下一期开始我们就进入本次指南解读的第十章节：除菌过滤器、系统的使用，将会涵盖过滤系统灭菌，完整性测试，气体过滤器使用等实际操作中常遇到的问题。

热烈庆祝TSKgel® FcR-IIIA-NPR上市，回馈新老客户，即日起至2019年9月31日，凡购买下列产品即赠送精美礼品。优惠活动购买TSKgel® FcR-IIIA-NPR新品，一律半价，并赠送精美礼品一份。购买任一款UP-SW3000系列色谱柱，增送精美礼品一份。购买以下任意三支色谱柱，增送精美礼品一份。G3000SWXL 7.8*300ProteinA-5PW 4.6 x 3.5Butyl-NPR 4.6*100CM-STAT, 7um,4.6*100NEWS         2月18-21日，东曹生命科学在瑞士Interlaken成功举办了第11届HIC/DSP Bioseparation Conference。会议邀请到了分离与纯化领域的专家学者，从基础理论到工业规模级的纯化工艺，分享他们在生物大分子色谱分离和工艺设计等方面的专业知识与宝贵经验。       会议期间隆重推出了用于糖型及治疗性单抗高效分离的FcγRⅢA亲和色谱柱，该色谱柱是东曹公司专为抗体药物糖链结构的分析和ADCC效应测定而开发。TSKgel FcR-IIIA-NPR独有的产品优势    创新的分离技术  能够识别抗体Fc段N-糖链的结构差异，并根据抗体与Fc受体之一的FcγIIIA之间的亲和性来实现抗体分离。 优异的稳定性   利用蛋白重组技术对Fc受体进行修饰，显著提升其化学稳定性。 短时间内快速分析  由于FcγIIIA会特异性结合抗体Fc区，即使是含有杂质的细胞培养上清液也可以直接上样分析。目前为止，传统的抗体活性检测方法主要有细胞ELISA法或SPR等手段，不仅需要昂贵的设备及繁琐的操作，且实验成本高耗时较长。TSKgel FcR-IIIA-NPR色谱柱的推出将给抗体活性检测带来新的思路和方法。同时该色谱柱还能应用在研发前期细胞株的筛查、细胞培养条件的优化、以及对培养过程的质量监控等环节。

“  《指南》中提到“完成过滤工艺的验证之后, 还应当定期评估产品性质和工艺条件，以确定是否需要进行再验证。””哪些改变可能需要再验证？过滤验证是针对特定的产品和特定的工艺，评估过滤器的性能。因此，这三个变量中任何一个发生改变均需要评估是否需要再验证。 产品改变 – 任何产品配方发生改变（包括API或辅料浓度和pH的改变），若先前的验证未包括这些产品变量，均需要再验证。细菌截留实验、完整性测试和化学兼容性验证必须重新进行验证。对于可提取物测试，只有这些改变会影响模型溶剂的选择时，才应当重新进行可提取物测试或浸出物测试。 过滤器改变 – 若膜材质和膜面积不变，只是装置改变（例如从筒式改成囊式），仅需重新进行可提取物研究，某些情况下还需重新进行化学兼容性实验。若滤膜材质改变，则需要重新进行所有项目的验证。若滤膜材质相同，但孔径发生改变，除了化学兼容性实验不需要再验证外，其余实验都需要再验证。当过滤器尺寸改变导致过滤表面积变化时，若单位过滤面积的过滤体积、压力、流速或过滤时间增加，则可能必须重新进行细菌截留实验。 工艺改变 – 保持其它所有变量（例如过滤器和产品）恒定，提高其它关键工艺参数『例如通量（流速/ 单位过滤面积）』、压力、过滤器/ 产品接触时间或过滤体积/ 单位过滤面积），若超出先前测试条件，则需要重新进行细菌截留验证。在特定情况下，可能也需要重新进行化学兼容性和可提取物研究。根据2008年修订的PDA第26号技术报告，若温度超过已验证的温度范围，则所有的过滤器验证均应当重新执行。由于灭菌条件会影响可提取物的水平，所以如果灭菌方法改变或灭菌条件（例如时间和温度）提高，则需要重新进行可提取物的验证。方法学应当有变更控制计划，一旦变化发生，就应该对验证文件进行复核。同时进行风险评估，以确认对于生产的安全性和药品品质来说关键的最有可能改变验证状态的系统和工艺参数。对这些设备的验证，应当列在例行再验证时间表上，或进行更常规的验证复核。例如，灭菌柜通常需要每年进行再验证，而过滤器则不是这样。这样可能因过滤工艺的改变而带来的验证状态的改变未被注意到。因此必须定期复核过滤器验证的参数，特别是当有工艺改变或工艺条件偏移时。以下是关于如何评价当前过滤验证状态的建议。? 确认当前生产的所有产品。? 它们是否经过验证？若是：     ? 针对当前的工艺条件，复核以前做的验证。     ? 过滤工艺是否有改变？     ? 在验证之后，产品配方是否有更改？（配方的改变可看作是“新”产品）? 确认进入临床2期或3期的产品，以及将提交新药申请的产品。? 所有过滤工艺是否均经过验证？若您依然对再验证评估有所疑问，默克BioReliance®验证实验室可免费为您提供再验证评估和咨询。

麻痹性贝类毒素（PSP）是一种神经毒素，并非来自贝类生物体本身，而是贝类摄食有毒藻类，并在其体内蓄积、放大和转化等过程中形成的生物毒素。人体若误食含有此类毒素的贝类则会产生麻痹性中毒现象，轻者口唇麻木、四肢肌肉麻痹等症状，重者可导致呼吸肌麻痹而死亡。——百度百科目前PSP的测定主要有酶联免疫法、液相色谱法-荧光法和液相色谱-串联质谱法。本文中实验参照食品安全国家标准GB 5009.213-2016，采用HILIC色谱柱TSKgel Amide-80（2.0 mmI.D.X 25 cm,5μm）配合串联质谱多级反应监测，对毒性较大，比较常见的10种PSP进行选择性分离和定量分析。分析条件色谱柱: TSKgel Amide-80 (2.0 mmI.D.×25 cm, 5 μm)流动相A: 甲酸铵缓冲溶液 (5 mmol/L)流动相B: 酸化乙腈 (0.5% 甲酸)流速: 0.25 mL/min;   柱温: 30 ℃;   进样体积: 20 μL质谱参考条件a) 离子源: 电喷雾离子源b) 扫描方式: 正离子扫描c) 监测方式: 多反应监测模式,麻痹性贝类毒素的母离子,子离子和碰撞能量见原文中表2d) 喷雾电压: 4500 Ve) 离子传输毛细管温度: 300 ℃f) 锥孔电压: -10 Vg) 雾化气流速: 11.7 L/minh) 辅助气流速: 1.7 L/mini)  碰撞气压力: 1.5 mTorr分析结果图1. 10种麻痹性贝类毒素标准溶液的多反应监测色谱图图2. 青蛤样品添加麻痹性贝类毒素特征离子流图 

2019年2月，东曹生命科学（Tosoh Bioscience）在全球范围内推出了其在生物制药领域的创新产品——用于抗体药物分析的高性能亲和色谱柱TSKgel® FcR-IIIA-NPR。该色谱柱是将重组人FcγIIIA作为配基，键合到非多孔亲水聚合物基质的填料上，并充填至PEEK色谱柱内。是专为抗体药物糖链结构的分析和活性测定而开发。抗体药物主要通过动物细胞培养进行生产。近几年的研究发现，抗体Fc段的糖链结构会对药效产生很大影响。这可以理解为糖链结构差异会影响抗体与引起免疫反应的效应细胞上的Fc受体之间的结合。因此，对抗体药物糖链结构的分析在质量控制中至关重要。TSKgel FcR-IIIA-NPR独有的产品优势 创新的分离技术  能够识别抗体Fc段N-糖链的结构差异，并根据抗体与Fc受体之一的FcγIIIA之间的亲和性来实现抗体分离。 优异的稳定性   利用蛋白重组技术对Fc受体进行修饰，显著提升其化学稳定性。 短时间内快速分析  由于FcγIIIA会特异性结合抗体Fc区，即使是含有杂质的细胞培养上清液也可以直接上样分析。目前为止，传统的抗体活性检测方法主要有细胞ELISA法或SPR等手段，不仅需要昂贵的设备及繁琐的操作，且实验成本高耗时较长。TSKgel FcR-IIIA-NPR色谱柱的推出将给抗体活性检测带来新的思路和方法。同时该色谱柱还能应用在研发前期细胞株的筛查、细胞培养条件的优化、以及对培养过程的质量监控等环节。东曹将在EBC大会期间的新品发布会上，向广大用户介绍这款高性能色谱柱产品，敬请关注！ 新品发布 抗体药物ADCC效应分析的新FcR色谱技术演讲人：潘明祥，副总经理东曹（上海）生物科技有限公司时间：3月2日  10:50-11:10地点：国际青年文化中心5楼 中华厅东曹展台：5楼 VIP2

（七）除菌过滤工艺验证分项解析前文已经详细介绍了性能确认和工艺验证的区别及关系，验证主计划及验证的时间点和考虑要素，现在我们详细介绍《指南》中描述的五个验证试验项目。除菌过滤工艺验证话题业内已经热烈讨论过很多年了，针对可提取物、浸出物、起泡点等内容我们曾经也做过详细的解析，详细信息请参见下文：?  可提取物和浸出物?  如何对可提取物和浸出物进行安全性评估?  基于产品润湿的起泡点测试除上述三项外，本文再详细介绍微生物截留，化学兼容性及吸附研究三个方面的内容。1.微生物截留试验微生物截留试验是通过评估生产实际过滤工艺后模拟最差条件工艺参数，过滤含有一定量挑战微生物的产品溶液或者产品替代溶液，以确认除菌过滤器的微生物截留能力。微生物截留试验应当证明滤膜孔径分布不受药品或工艺的影响，并且药物和工艺均不会将微生物的大小降低到使其能穿过除菌级过滤器。这一部分的验证对于药品的无菌保证水平是相当关键的。1.1挑战用微生物的选择缺陷型短波单胞菌（ATCC 编号19146）是监管机构和行业内公认的除菌过滤器验证中细菌截留实验的标准挑战微生物。原因是：? 该细菌尺寸非常小，直径大约为0.3 ～ 0. 4 微米，长度0. 6 ～ 1. 0 微米。? 它是水源性的革兰氏阴性菌，对于药品生产过程中可能的污染菌有广泛的代表性。? 不致病且能相对稳定地产生大小和形态可重现的单细胞菌群。缺陷型短波单胞菌的加入量应当能够在预定的时间内提供稳定的挑战浓度，并应尽可能确认缺陷型短波单胞菌的单分散性状态，不能聚集粘连成团。在有些情况下，缺陷型短波单胞菌可能不能代表最差条件，例如在实际生产现场的药品中发现比缺陷型短波单胞菌更小的菌则需要考虑采用该细菌进行细菌挑战实验。如果使用其他细菌，应保证该细菌足够细小至足以挑战除菌级别过滤器的截留性能，并能代表药品中发现的最小微生物。应尽可能地进行微生物负荷的鉴别和量化研究，掌握所分离的微生物的形态学特征，为挑战性微生物的选择提供依据，同时也能稳定地培养出大小和形态合适的挑战菌。1.2挑战用滤膜或者滤器选择? 在除菌过滤验证中使用滤膜还是全尺寸工艺过滤器取决于验证的目的。微生物截留实验的目的是验证特定膜材的细菌截留效能，那么使用小的测试膜片是满足条件的。? 微生物挑战实验中所用的滤膜必须使用和实际生产中所用过滤器完全相同材质的的滤膜，应包括多个批次的滤膜（通常三个批次）。? 其中至少应有一个批次为低泡点（低规格）滤膜。低泡点（低规格）滤膜是指其完整性测试的数值符合但是非常接近（例如，10％之内）过滤器生产商提供的滤器合格规范限值，以在微生物挑战实验中使用最差条件的滤膜。? 如果在验证中没有使用低泡点滤膜，那么在实际生产中所使用的标准溶液滤芯泡点值必须高于验证实验中所使用滤膜的最小泡点值。? 微生物截留验证研究中使用的过滤膜的物理完整性检测数值应包括在试验报告中。物理完整性检测应使用具有标准值的物料进行，如水、70/30%异丙醇、或其他溶液。微生物挑战试验前后均应进行完整性测试。1.3 微生物截留试验条件选择由于存在药品导致微生物大小减小的可能性，因此尽可能地将挑战微生物在药品中直接培养进行挑战。有些情况下可能需使用替代溶液进行试验，例如，产品有杀菌性等。这种情况下，可行的替代方案是先用测试过滤器在模拟实际工艺的最差工艺参数条件下暴露于药物溶液当中，然后在第二阶段使用改性后的溶液或修改过的工艺条件进行进行细菌挑战试验。对于具有相同组分而只有浓度不同的同一族产品，可以用挑战极限浓度的方法进行验证，替代性地接受中间的浓度。如果某一产品被确定为最差情况的代表，需要提供合理的数据。过滤温度、过滤时间、过滤批量和压差或流速会影响细菌截留试验的结果。根据实际生产条件，建议对实际生产的过滤工艺进行一次彻底评估，以便合理设计微生物截留实验条件。需要包含在评估范围内的因素有：? 过滤药品的组分和性质（配方、表面活性剂、添加剂、pH值、粘度、渗透压、离子强度）? 过滤工艺条件（过滤时间、过滤温度、过滤压差、过滤流速、过滤批量和重复使用）? 过滤器信息及过滤链组成，是否是冗余过滤？? 实际药品和生产环境中实际生物负荷的特点和水平按照最差条件选择要求，微生物截留试验过程中过滤时间应达到或者超过实际生产过程的最长工艺时间，过滤压差或流速应达到或超过实际生产过程的极限压差和/或单位面积的极限流速（在过滤器制造商的设计规范内）。在验证过程中同时模拟压差和流速是不可能的。在设计挑战试验条件时过滤器的使用者应该确认哪个参数与特定工艺的相关性更高，以便为微生物截留试验条件的确定提供依据。不同参数的风险影响可以参见下表1。表1. 过滤因素风险影响值得提出的是，不同过滤器生产商之间的验证报告是不能相互覆盖的。如果在生产过程中有两个不同生产商提供同一材质的过滤器，验证应该分别进行。1.4 微生物截留实验结果判读如果微生物截留验证实验中，在过滤器的下游检测到挑战微生物，则应进行调查。如果调查确认挑战微生物能穿透完整性检测达标的过滤器，那么就应重新考虑此种类型过滤器在该工艺条件下的适用性。2.化学兼容性验证过滤工艺化学兼容性验证的目的是用来评估在特定工艺条件下过滤装置与料液的化学相容性，以避免可能的过滤器受损或变形，以防止料液受到浸出物或颗粒物的污染。2.1 化学兼容性实验考虑因素? 跟细菌挑战实验不同，化学兼容性试验应涵盖整个装置，不只是滤膜。在过滤过程中，工艺的液压和化学腐蚀的影响，相比滤膜整体过滤器会有更显著的体现。过滤器装置中滤膜以不同支撑方式装配，而且其它构造材料对过滤器的完整性和性能也极为重要。? 试验的设计应考虑料液性质、过滤温度和接触时间等。按照最差条件选择要求，化学兼容性实验过程中过滤时间应达到或者超过实际生产过程的最长工艺时间，实验过滤温度应达到或者超过生产过程的极限工艺温度。? 由于过滤装置与过滤料液或溶剂之间可能存在诸多化学相互作用，过滤器生产商所提供的代表性溶剂的化学兼容性表通常只作为参考，过滤器使用者需要进行更全面和更有针对性的测试。2.2 化学兼容性实验检测项目化学兼容性实验检测项目包括：? 接触料液前后的目视检查? 过滤过程中流速变化? 滤膜重量/厚度的变化? 过滤前后起泡点等完整性检测数值的变化等。化学兼容性验证应将过滤器暴露在药物溶液使用最差的工艺条件进行。值得注意的是，过滤器中滤膜的兼容性也可在微生物截留测试中得到确认，因为暴露于实际药品的滤膜已表明能够提供无菌滤液。可提取物结果也揭示了过滤器装置的化学相容性，因为在实际验证研究中除了过滤器材料之外其他外来组分必须不存在。3.吸附研究吸附是所过滤的料液中的某些成分粘附在滤膜上的过程，可能影响料液的构成和浓度。过滤器中吸附性的材料包括滤膜、硬件和支撑性材料。吸附试验条件可以根据实际生产条件确定，流速、过滤时间、料液浓度、防腐剂浓度、温度和pH值等因素都可能影响吸附效果。吸附试验中采用的检测方法可以采用产品质量标准中所确定的相关检测方法。

免疫球蛋白IgG，目前已作为功效成分添加于保健食品中，该成分对于增强免疫力、调节动物体的生理功能和某些特定物质的代谢等均有一定效果。       食品安全国家标准GB/T 5009.194-2003中的IgG检测法，是根据高效液相亲和色谱的原理，在磷酸盐缓冲液条件下免疫球蛋白IgG与配基连接，在pH2.5的盐酸甘氨酸条件下洗脱免疫球蛋白IgG。                 本文中采用了亲和色谱柱 TSKgel Protein A-5PW 参照GB/T 5009.194-2003，对初乳素样品中的IgG含量进行了分析。分析条件仪器：UltiMate3000色谱柱：TSKgel ProteinA-5PW (4.6 mmI.D.×3.5 cm)流动相A：pH6.5, 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液流动相B：pH2.5, 0.05 mol/L甘氨酸盐酸盐缓冲液流速：0.4 mL/min柱温：35 ℃进样体积：20 μL检测器：UV 280 nmIgG对照品溶液色谱图初乳素样品溶液色谱图      分析结果表明，IgG与前面杂质峰的分离度Rs为18.99，两次进样测定结果的算数平均差值与算术平值比值为0.26%，完全满足国标中规定的检测要求。

“ 前文已经介绍了除菌过滤的确认和工艺验证，以及开展验证工作首先应确立的验证主计划，那么什么时候应当进行除菌过滤工艺验证呢？像绝大多数验证问题一样，答案是“这取决于实际情况。”从药品安全的角度来说，最迟应当在报生产前（也即临床Ⅲ期）的时候将验证材料提交给药监部门。但对于药企来说还需要考虑工艺的风险评估，每种药品情况都不一样，越在药品研发的早期(第Ⅰ阶段或第Ⅱ阶段早期)开始验证，风险越低。一般来说，很多药品生产企业的生命周期管理流程要求过滤验证在第2 阶段进行。”临床试验药品的制备由于缺少固定的生产工艺、临床试验设计的多样性以及经常需要随机化和盲试，使其与市售药品相比更为复杂，增大了产品交叉污染和混淆的风险。此外，对产品的药效和毒性的知识可能不完善，可能缺少完整的工艺验证。因此，与用市售药品治疗的患者相比，参与临床试验的对象暴露于更高的风险。关于临床试验药品的法规指南，旨在尽可能限度地降低该风险。在这些法规指南中均建议评估制备配置和工艺，以识别潜在危险，并采取适当行动以消除或减轻潜在危险以保证临床试验药品的质量。受试人群安全的一个关键要素是产品无菌性，因此在相关的法规中，有关的所有方面均被特别强调。临床试验药品的制备应按照GMP要求执行，目的也是确保试验结果可靠性。仅当该结果不受安全性不足、制造过程不令人满意（可能影响质量或药效）的影响时，才能确保可靠。总之，临床试验药品结果的可重现性，仅当相同或不同临床试验所用各批次药品具有一致性时，这一点才能够实现。药物开发早期阶段的挑战：? 尽可能限度地降低患者风险? 从临床试验获得可靠、可重现、可靠的临床试验结果? 在设计、优化工艺阶段时获取相关知识以节约时间和资金因此，作为临床试验批的制备的一个结束步骤，除菌过滤应当在早期临床阶段（第I 阶段和第II 阶段早期）进行确认，以证明它能有效地生产无菌产品，对产品性质没有不良影响。当然也有特殊情况，例如产品剂型配方难以保证在更早的时间进行验证，或者难以利用现有的知识基础开发非常相似的产品。过滤验证本身可视为生命周期过程，并不是孤立的行动。该理念可与推荐建议的行动措施结合起来，在实际使用过程中尽可能早地降低除菌过滤工艺过程的风险，并保持与质量源于设计理念和生产安全的临床产品总体目标相一致。所遵循的建议主要集中在除菌级过滤器验证的三个主要因素：化学兼容性、细菌截留实验及可提取物和浸出物评估。每个建议的目的是为了在实际使用过程中获得尽可能多的与过滤工艺有效性相关的信息，从而消除风险和未知事件，在工艺过程中制定质量标准。其实，除菌过滤工艺设计和验证应视为生命周期过程，而不是在单个时间点上出现的某个事件。图1 不同时期验证的考虑要素化学兼容性：化学兼容性是非常重要的，甚至可以从第1 阶段开始评估化学兼容性，因为不相容的液体和过滤器结合非常有可能导致颗粒或浸出物污染和/或细菌穿透。但是早期开发中药品可提供的量可能不能满足整个过滤器的化学兼容性实验.因此，书面评估（paper-based assessment）可以作为一个很好的开端，产品溶剂、有效成分和赋形剂可根据材料手册和供应商发表的信息以及从非常相似的产品剂型配方的开发和确认中获得的知识进行评估。如果书面评估发现任何可疑的不兼容性，则应进行实验验证。对于产品量非常有限的贵重药品可以只测试滤膜，或者如果兼容性问题只与溶剂或赋形剂有关，可以使用去掉主成分的安慰剂测试整个滤器。尽管过滤工艺未明确确定，但可以依据过滤器/产品总接触时间不超过无菌灌装工艺确认的时间，可以获得兼容性实验设计空间。同样，兼容性实验极限温度的设定可以依据大部分的过滤都是在室温下进行，或者使用产品本身能耐受的极限温度，则可确定相同的设计空间。缺乏确定的最终产品剂型配方是早期开发期间确定兼容性时面临的另一个挑战。但是，实施设计空间策略可应对该挑战。此时，可根据单种成分和pH 限值的数量来配制假定产品， 从而可作为最差情况的配方依据，用来评估过滤器的兼容性。微生物截留：在早期开发阶段，微生物截留是一个用来评估除菌过滤工艺风险的重要指标。当评估微生物截留时， 具有开发非常相似的配方（例如mAb）经验的药品生产企业，可以依靠类似药品与过滤器的过滤情况结合影响微生物截留的重要参数进行评估，例如表面张力、摩尔渗透压浓度及物理参数等。正确验证微生物截留应从产品配方开始，通过创建所需的参数，更加明确地规定过滤设计空间，设计行之有效的工艺过程和产品特异性验证过程：确定的产品配方、过滤能力、流量、极限压力、接触时间、期望的生物负荷和过滤模式（恒压或恒定流速）。相反，不具有已有经验的新药开发商应尽可能早地作出更大的努力证明除菌过滤的效率。特别是，含有可降低表面张力的表面活性成分的新配方或纳米颗粒配方（例如脂质体疫苗）将会产生附加风险。在早期开发期间，当产品量非常少，按生产规模的产品所要求的相同标准进行工艺和产品特异性的微生物截留测试有点不切实际。但是，改进的方法可为药品开发商提供一个早期预示，以便除菌过滤效率在后期的开发工作中能够进行有效的验证。可对微生物截留实验所采用的通用的方法进行改进，比如采用一张挑战滤膜而不是通常的三张滤膜进行测试。可提取物&浸出物：实际上，应在初始过滤器选择时就尽早开始进行可提取物和浸出物（E&L）评估，此时只有过滤器符合药典要求，同时应选定其它验证要求，这些要求包括符合USP VI级要求，材料应满足法规21 CFR 177—82 规定的间接食品添加剂要求，并且要求不会产生纤维脱落。确认工艺条件、工艺液体和过滤器之间可接受的兼容性增加了得到可接受的可提取物和浸出物（E&L）评估的合适材料的可能性， 产品在一定程度上不会出现可产生患者健康风险的添加剂。使用模拟溶剂进行可提取物研究有助于新药的早期开发，因为该研究不需要实际药品进行实验。合理的设计空间需要考虑到过滤工艺、预计接触时间以及温度以选择相关合适的模拟溶剂。如果不能确定最合适的模拟溶剂，可评估特殊工艺过程，选择最差条件的模拟溶剂。因此， 认证确认信息和可提取物评估可提供一个强有力的指示，所选取的过滤器是否会对产品产生不利影响。在整个研发过程中，使用相同的构造材料，可建立进一步的可信度，以确保在临床试验和稳定性研究中不会出现浸出物和产品反应的情况。在药品研制后期，当产品配方已确定，可进行浸出物评估，以进一步论证其安全性和质量；或者已在商业化生产中使用的过滤器，其灭菌方法和工艺，各项预处理步骤如冲洗等已确定，也可进行进一步的浸出物评估。在不同阶段进行除菌过滤工艺验证有不同的考量因素，一般来说，越在药品研发的早期(第Ⅰ阶段或第Ⅱ阶段早期)开始验证，风险越低，但所需要考虑的因素和不确定性会更多，因此可通过上述的评估和操作方法来达到降低风险和提高收益的双赢。

寡核苷酸的SEC分析SEC分离模式常用于分析因核碱基数、磷酸基不同导致的分子量差别，对寡核苷酸进行简单的质量控制或纯度研究。TSKgel UP-SW3000、G3000SWXL以及TSKgel G2000SWXL这三款SEC色谱柱都非常适合用来分析寡核苷酸。天然型DNA核酸药物Defitelio就是采用TSKgel G2000SWXL进行质量分析的。分离实例：脂质体包裹的siRNA的SEC分离参考文献: Handbook of analysis of oligonucleotides and related Products, Feb. 23 (2011) 125，Edited by J. V. Bonilla et al.寡核苷酸的IEC分析在IEC分离模式中，如果使用无孔填料的色谱柱可以提高分辨率。TSKgel DNA-NPR(粒径2.5 μm)和TSKgel DNA-STAT(粒径5 μm)都是采用无孔填料的色谱柱。在常规HPLC系统上推荐优先使用TSKgel DNA-STAT。该色谱柱填料粒径为5 μm，操作压力低，样品载量大。在样品吸附强的情况下，即使在高温、高盐浓度下(2～3 mol/L)进行梯度分离，DNA-STAT的分离带也更宽，分辨率更高。分离实例: TSKgel DNA-NPR和DNA-STAT色谱柱对相同长度(20mer)的4种寡核苷酸的分离分离实例: TSKgel DNA-NPR阴离子交换色谱柱分离合成的13mer寡核苷酸核酸分析的重点分离核酸时需要根据样品的稳定性和大小来选择或更换洗脱液。如果核酸的稳定性很高，可以通过采用碱性溶液(NaOH，pH 12)和高温(60℃)来提高分辨率。对于稳定性差的样品，则在中性(pH 7～8)，40°C条件下分离。如果样品是超巨大双链DNA，如质粒DNA，使用TSKgel DEAE-NPR (4.6 mm I.D.×3.5 cm)的话不仅可以获得高分辨率，而且回收率也会更好。