全球医药品销售额排行前100种产品中,生物药占据了50%,而抗体药更是在销售额排行的前20种药品中占了9种。近年来,医药界正在研发小分子抗体,这种抗体不但保持了抗体的高度特异性,其分子量还小于完整的抗体。小分子抗体有许多种类,除了抗体片段(Fab)以外,在利用基因工程技术制备的人工抗体中,还有单链抗体(scFv)、串联单链抗体(tandem scFv)、更为单纯的双链抗体(diabody)等。
这些小分子抗体不含有Fc片段,所以无法用Protein A填料进行亲和纯化。因此,使用与Fab片段的Kappa轻链(kappa Light chain)结合的Protein L填料,能够有效进行亲和纯化。TOYOPEARL AF-rProtein L-650F具有抗体吸附载量高,耐碱性优异的特点。可用0.1 mol/L NaOH溶液清洗,所以与传统的Protein L填料相比,更有利于提高生产能力和降低生产成本。
● 高载量型TOYOPEARL AF-rProtein L-650F的产品特性
参数 | 规格 |
粒径 (μm) | 30 – 60 |
配体 | 重组Protein L (由大肠杆菌表达) |
配体固定化 | 多点结合 |
IgG吸附载量 (静态) | >64 g/L |
微生物量 | |
菌体数 (CFU/mL) | <100 |
内毒素 (EU/mL) | <10 |
异物 | <6 |
溶出物 | <0.2 % |
● TOYOPEARL AF-rProtein L-650F的优势
・高吸附载量 :是市售Protein L填料载量的约1.5倍
・提高耐碱性 :可用0.1 mol/L NaOH清洗,可重复使用
・低配体脱落量 :Protein L配基为多点结合,填料配基脱落率较低
・高速分离、处理 :填料骨架刚性强,所以可用大口径柱进行高流速分离(驻留时间约为2-3分钟)
・提高生产能力 :高载量、耐碱性,可在生产中降低填料的成本
・稳定提供 :可确保稳定提供超过10 L的大量填料
・筛选用预装柱 :提供1 mL和5 mL预装柱,用于工艺开发
● 使用Protein L填料纯化抗体分离单链抗体(scFv)和tandem scFv的分离条件举例:
吸附溶液:0.02-0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲溶液 (pH 6.5)
淋洗:
scFv、tandem scFv(CHO细胞培养液):含有0.25-1 mol/L精氨酸和5-10 %异丙醇的吸附溶液
scFv(大肠杆菌的包涵体):含有2 mol/L盐酸胍的吸附溶液*
洗脱:0.1 mol/L 柠檬酸或甘氨酸/HCl (pH 2.0-pH 3.0)
清洗:酸性溶液 pH 2.0-pH 2.2
CIP: 0.05–0.1 mol/L NaOH,接触时间为10–15分钟(限定使用浓度不超过0.1 mol/L NaOH水溶液)
(用0.1 mol/L NaOH水溶液浸泡9小时后,吸附量仍维持 90 %)
10–20 %乙醇和异丙醇也可有效去除疏水性杂质
* Reference:Tosoh Bioscience LLC Application Note, Capture of a scFv from E.coli using TOYOPEARL® AF-rProtein L-650F
● 使用TOYOPEARL AF-rProtein L-650F纯化 CHO细胞培养液中tandem scFv抗体,对其吸附载量和淋洗的效果
样品载量 (mg) | 吸附 中间清洗液 pH |
中间清洗液 |
洗脱液pH | 回收率 (%) | 单体 (相对%) | 聚集体 (相对%) | 抗体片段 (相对%) |
HCP (ppm) |
DNA (ppm) | 脱落的 Protein L (ppm)* |
Feed | - | - | - | - | 24.6 | 63.2 | 12.3 | 14,782,068 | 2,676 | - |
5 | 6.5 | - | 2.85 | 86.9 | 94.5 | 5.1 | 0.4 | 7,341 | 7 | < LOD |
5 | 6.5 | + 0.25 M Arg | 2.85 | 85.5 | 93.4 | 6.1 | 0.5 | 6,872 | 2 | < LOD |
5 | 6.5 | + 0.25 M Arg + 5% iPrOH | 2.85 | 85.4 | 93.9 | 5.7 | 0.4 | 6,016 | 1 | < LOD |
20 | 6.5 | - | 2.85 | 83.4 | 83.4 | 16.1 | 0.4 | 10,522 | 3 | < LOD |
20 | 6.5 | + 0.25 M Arg | 2.85 | 90.1 | 80.8 | 18.7 | 0.4 | 8,368 | 2 | < LOD |
20 | 6.5 | + 0.25 M Arg + 5% iPrOH | 2.85 | 90.1 | 82.9 | 16.8 | 0.4 | 6,966 | 1 | < LOD |
Buffer; 0.1 mol/L sodium citrate buffer (pH 6.5) LOD; Limit of detection
Column size; 1 mL
※使用添加精氨酸(Arg)和异丙醇(iPrOH)的溶液进行淋洗,有效去除了HCP、DNA等杂质。
● Protein L纯化后的层析步骤
在Protein L填料纯化后的下一个步骤中使用以下其他模式的填料,能够进一步有效去除杂质。
・离子交换填料 :TOYOPEARL NH2-750F、Sulfate-650F(耐盐性离子交换填料)
・疏水填料 :TOYOPEARL PPG-600M、Phenyl-600/650M、Butyl-600/650M、Hexyl-650C
・混合模式填料 :TOYOPEARL MX-Trp-650M
● Protein L填料和筛选用预装柱产品一览表
货号 | 产品名称 | 吸附载量 (g/L) | 包装规格 | 备注 |
0023486 | TOYOPEARL AF-rProtein L-650F | ≥ 64 | 10 mL | 填料(瓶) |
0023487 | TOYOPEARL AF-rProtein L-650F | ≥ 64 | 25 mL | 填料(瓶) |
0023488 | TOYOPEARL AF-rProtein L-650F | ≥ 64 | 100 mL | 填料(瓶) |
0023494 | ToyoScreen AF-rProtein L-650F | - | 1 mLX 5 | 预装柱,需要使用ToyoScreen Holder(柱套) |
0023495 | ToyoScreen AF-rProtein L-650F | - | 5 mLX 1 | 预装柱,需要使用ToyoScreen Holder(柱套) |
0023496 | ToyoScreen AF-rProtein L-650F | - | 5 mLX 1 | 预装柱,需要使用ToyoScreen Holder(柱套) |
0045162 | MiniChrom AF-rProtein L-650F | - | 5 mL | 预装柱,8 mm I.D. x 10 cm |
0045065 | RoboColumn AF-rProtein L-650F | - | 200 uL X 8 | 98微孔板专用 |
0045066 | RoboColumn AF-rProtein L-650F | - | 600 uL X 8 | 98微孔板专用 |
0021400 | ToyoScreen Holder | - | - | 柱套,转接头(入口1 mL专用),(入口5 mL专用),转接头(出口)各1个, 堵头2个 |
※ 如需购买Protein L填料的配基脱落检测套装,请咨询我公司销售人员或代理。
※ 纯化完整的抗体,请使用高载量、耐碱型的TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F填料 。
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