抗体药物纯化工艺中最关键的第一步使用Protein A填料进行亲和分离。通过这一步,抗体纯度可达到95%左右。但作为抗体药物,纯度还远远不够,需要进行进一步纯化。主要杂质包括多聚体、抗体片段,来自宿主细胞的蛋白质(HCP)和DNA、病毒、以及自Protein A填料脱落下来的Protein A配基。这些杂质可以通过阴离子交换填料和阳离子交换填料(或混合模式填料)或疏水填料去除。除此之外,往往也会使用阳离子交换填料通过吸附、洗脱模式来进行抗体的纯化。
TOYOPEARL Sulfate-650F是一款具有硫酸根官能团的耐盐型阳离子交换填料。对抗体的吸附载量高,可以有效地去除多聚体,宿主细胞蛋白以及脱落的Protein A配基。
l 高载量・耐盐型阳离子交换填料Toyopearl Sulfate-650F的产品特性
・ 是一款具有耐盐性的(salt-tolerant)阳离子交换填料,在较高的盐浓度下对抗体也有较高的载量。
・ 填料的孔径大,可以有效去除抗体的多聚体、宿主细胞蛋白(HCP)以及其他杂质。
・ 具有很好的耐碱性,可以使用0.1 mol/L或者0.5 mol/L NaOH溶液重复对填料进行清洗和再生。
・ 可以有效地去除病毒。
・ 为了方便初期的填料筛选,配备了专门的ToyoScreen®(1 mL, 5 mL), MiniChrom® (5 mL)预装柱。
l 使用吸附、洗脱模式纯化抗体
分离条件:
层析柱:Toyopearl Sulfate, 6.6 mmI.D.× 3.0 cm (1.0mL)
缓冲液:吸附 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 0.1 mol/L NaCl
洗脱 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 0.26 mol/L NaCl
洗脱 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 0.29 mol/L NaCl
洗脱 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 0.32 mol/L NaCl
清洗 50mmol/L acetate-Tris (pH 5.2), 1.0 mol/L NaCl
碱清洗 0.5 mol/L NaOH
流速 :45 cm/hr (4分钟保留时间)
检测 :UV (280 nm)
温度 :室温
样品 :通过Protein A层析后收集的单抗(19.1 g/L)
纯化后的杂质含量 | Protein A纯化后 | Sulfate-650F纯化后 |
样品负荷量(mg/mL填料) | 48 | 101 |
单体回收率(%) | n/a | 83 |
二聚体(%) | 3.90 | 2.40 |
多聚体(%) | 0.54 | 0.07 |
HCP(ppm) | 1,260 | 134 |
Protein A配基(ppm) | 1.20 | 0.04 |
* Protein A纯化步骤均使用Toyopearl AF-rProtein A HC-650F。
※大量的样品进行上样(100 mg/mL充塡剤)、用盐浓度为0.26 mol/L 的NaCl进行洗脱。纯化结果,单体的回收率为83%,多聚体、HCP、脱落的Protein A配基等杂质均被有效地去除。
参考資料: Application Note; Increase monoclonal antibody purity with TOYOPEARL Sulfate-650F resin; Strong cation-exchange resin for capture and
removal of mAb Aggregates, Tosoh Bioscience LLC (2016).
l 使用Protein A填料的抗体纯化的层析工艺案例
*使用流穿模式(FT)的情况下,根据抗体的种类来优化填料的粒径以及缓冲液的盐浓度,一般来说推荐使用160mM以上的盐浓度。
Protein A填料 : TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F
阳离子交换填料 : TOYOPEARL Sulfate-650F, GigaCap S-650M, GigaCap CM-650M
: TOYOPEARL MX-Trp-650M(阳离子交换型混合模式填料)
阴离子交换填料 : TOYOPEARL NH2-750F, GigaCap Q-650M, GigaCap DEAE-650M
疏水填料 : TOYOPEARL Butyl-650/600M, Phenyl-650/600M, PPG-600M, Hexyl-650C
l TOYOPEARL Sulfate-650F产品参数
项目 | 规格 |
官能团 | 硫酸根 |
离子交换容量(meq./L) | ≥0.53 |
粒径(μm) | 30-60 |
静态吸附载量(IgG./L) | ≥114 |
菌体数(CFU/mL) | ≤100 |
内毒素(EU/mL) | ≤10 |
异物 | ≤6 |
溶出物 | ≤0.2% |
l TOYOPEARL NH2-750F填料以及筛选用预装柱产品一览表
货号 | 产品名 | 离子交换容量(eq/L) | 吸附载量(g/L) | 粒径 (μm) | 包装 (mL) | 备注 |
0023468 | TOYOPEARL Sulfate-650F | 0.07-0.13 | ≧ 70 | 30-60 | 250 | 散装填料 |
0023472 | TOYOPEARL Sulfate-650F | 0.07-0.13 | ≧ 70 | 30-60 | 1 mL × 6 | 筛选用预装柱;需要同时使用ToyoScreen Holder(柱套) |
0023473 | TOYOPEARL Sulfate-650F | 0.07-0.13 | ≧ 70 | 30-60 | 5 mL × 6 | 筛选用预装柱;需要同时使用ToyoScreen Holder(柱套) |
0045117 | MiniChrom Sulfate-650F | 0.07-0.13 | ≧ 70 | 30-60 | 5 mL | 预装柱:8 mm ID × 10 cm |
0021400 | ToyoScreen Holder | - | - | - | - | 预装柱配套用柱套 |
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