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艾杰尔飞诺美

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分享： 2013/01/05 13:30:38

固相萃取/LC-MS/MS 法检测动物源性食品中的金刚烷胺

一、背景

金刚烷胺是由金刚烷与溴进行卤化，再与乙腈在硫酸中反应，生成酰胺，再用碱水解而得。它可用于亚洲甲- Ⅱ型流感的预防和早期治疗，与抗菌素合用可治败血症和病毒性肺炎，并有退烧作用。也有抗震颤麻痹的作用，可适用于帕金森病的治疗。根据其药理作用，国内现在主要将金刚烷胺用于鸡、猪流感的预防和早期治疗，及猪传染性胃肠炎的防治。

鉴于金刚烷胺会在动物组织中有残留，所以政府有关部门开始禁止使用金刚烷胺等防治高致病性禽流感等一类病原微生物引起的病毒性疫病。我国对于动物源性食品中金刚烷胺残留含量的相关研究报道属于空白，也未曾制定或立项过国家标准、行业标准，国际上也无特定限量要求及相应检测方法。

本文采用甲醇-1% 三氯乙酸萃取、Cleanert PCX固相萃取净化、液相色谱- 质谱/ 质谱(LC-MS/MS) 技术建立动物源性食品中的金刚烷胺残留量的分析方法。

二、实验部分

2.1仪器与试剂

AB 4000+质谱检测器，配液相色谱仪；卓睿自动固相萃取仪；涡旋振荡混合仪；超声波振荡器；氮气浓缩仪。

Cleanert PCX固相萃取柱；盐酸金刚烷胺标准品（纯度99%）。甲醇、异丙醇 (色谱纯，博纳艾杰尔科技)、乙酸铵、甲酸、三氯乙酸均为色谱级、实验用水为超纯水；一次性无菌注射器（博纳艾杰尔科技）；微孔滤膜(0.20μm，直径13mm博纳艾杰尔科技)；专用过滤器（1μm，直径25mm，博纳艾杰尔科技）。

2.2 样品提取和净化

准确称取2g（精确至0.01g）试样至 50 mL 离心管中，加入10mL 甲醇-1% 三氯乙酸（50+50，v/v）溶液，漩涡30 s，超声30 min，8000r/min离心10 min，上清液用一次性专用过滤器注射器转移至10 mL 玻璃离心管中备用。

固相萃取净化过程：

活化：3mL甲醇，3mL水；上样：准确移取5 mL 上述提取液至Cleanert PCX固相萃取柱中；淋洗： 3 mL 2% 盐酸，3 mL 甲醇淋洗，控制流速为1 mL/min；洗脱： 5 mL 氨水-甲醇- 异丙醇溶液（5+80+15，v/v /v）洗脱并接收。

洗脱液在50℃水浴中氮气吹干，加1.0 mL 甲醇-水-甲酸溶液（10+90+0.1，v/v /v）溶解，用0.22μm滤膜过滤后供LC-MS/MS测定。

2.3色谱条件

色谱柱：Venusil ASB C18（2.1*150mm，3μm，150Å）；

流速：200μL/min；

柱温：30℃；

进样量：5μL；

表1 液相色谱分析流动相条件

Total Time(min)	Flow Rate(µl/min)	0.1%甲酸水	乙腈 (%)
0	200	70	30
10	200	70	30

2.4质谱条件

电离模式：电喷雾电离正模式；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度（TEM）：550℃，Curtian Gas: 10，Ion Source Gas 1: 70，Ion Source Gas 2:75

表2 质谱参数

化合物	保留时间/min	Q1	Q3	Decluster Potential	Collision Energy
金刚烷胺	6.88	152.2	134.9	77	24
			92.9	87	36
			78.9	78	40

下划线表示定量离子

三、实验结果

图1. 金刚烷胺标准品质谱图

图2. 鸡肉样品添加金刚烷胺标准品的质谱图（添加浓度为50μg/kg）

表1. 鸡肉样品中金刚烷胺添加回收率（n=5），添加浓度50μg/kg

名称	保留时间（min)	平均回收率（%）	RSD（%）
金刚烷	6.8	79.8%	8.37

四、订货信息

产品名称	规格型号	货号	报价
Cleanert PCX	60mg/3mL；50/PK	CX0603	1150
Venusil ASB C18	2.1*150mm，3μm，150Å	VS931502-0	3300
Prefilter专用过滤器	1μm，直径25mm, 100/pk	AS082501-G	570
微孔滤膜	0.22μm，直径13mm,200/PK	AM021320	120
一次性无菌注射器	5mL,100/pk	ZSQ-5ML	80
异丙醇	4L/瓶	AH232-4	360
甲醇	4L/瓶	S230-4	150