乙醇脱氢酶(ADH)活性检测试剂盒 微量法

乙醇脱氢酶（ADH）活性检测试剂盒说明书

 微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀；

2、 试剂二：临用前取 1 支试剂二加入 1mL 蒸馏水，可以-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融。1 支即可做 100T，为延长试剂盒使用时间，遂多给一支。

产品说明：

ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。

ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD⁺，NADH在340nm处有吸收峰，而NAD⁺没有；测定340nm 吸光度下降速率，来计算ADH活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

2、 细菌、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；16000g，4℃离心 20min，取上清液置冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

2、 试剂一在25℃水浴中保温30min以上。

3、 空白管：在微量石英比色皿//96孔板（UV板）中依次加入20μL蒸馏水、8μL试剂二、152μL试剂一和20μL试剂

三，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。ΔA空白管=A1-A2。（空白管只需做1~2个）

4、 测定管：在微量石英比色皿//96孔板（UV板）中依次加入20μL上清液、8μL试剂二、152μL试剂一和20μL试剂三，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A3和A4。ΔA测定管=A3-A4。

三、ADH活性计算

注意事项：

上清液蛋白质浓度需要另外测定。

实验实例：

1、 取 0.1g 大鼠肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007，ΔA 测定管=A3-A4=0.8351-0.5341=0.301，按样本质量计算酶活得：

ADH (U/g 质量) =1.61×(ΔA 测定管–ΔA 空白管)÷W=1.61×(0.301-0.007)÷0.1=4.7334 U/g 质量。

2、 取马血清直接检测，用微量石英比色皿测得计算 ΔA 空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007，ΔA 测定管=A3-A4=0.6369-0.6036=0.0333，按液体体积计算酶活得：

ADH ((U/mL) =1.61×(ΔA 测定管–ΔA 空白管)=1.61×(0.0333-0.007)=0.042343 U/mL。

3、 取小鼠血浆直接检测，用微量石英比色皿测得计算 ΔA 空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007，ΔA 测定管=A3-A4=0.7381-0.7093=0.0288，按液体体积计算酶活得：

ADH (U/mL) =1.61×(ΔA 测定管–ΔA 空白管)=1.61×(0.0288-0.007)=0.035098 U/mL。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！