eBioscience 可替代荧光 eFluor 450 Pacific BlueBD Horizen V450/BD Horizon Brilliant? Violet 421 (BV421) Brilliant? Violet 421 (BV421) VioBlue eVolve? 605 Qdot 605BD Horizon Brilliant? Violet 605 (BV605)Brilliant? Violet 605 (BV605)  eVolve? 655 Qdot 655BD Horizon Brilliant? Violet 650 (BV650) Brilliant? Violet 650(BV650)  Alexa Fluor 488 FITC/Cy2Alexa Fluor 488 PE-eFluor 610 PE-Texas Red (ECD)BD Horizen PE-CF594PE/Dazzle? 594 PerCP-eFluor® 710 PerCP-Cy5.5PE-Cy5.5PerCP-Vio700 PE-Cy7 PE-Cy7PE-Vio770 eFluor 660 APCAlexa Fluor 647 eFluor 710 Alexa Fluor 700 APC-eFluor 780 APC-Cy7APC-H7APC-Alexa Flour 750APC-Vio770 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120025.html

   阅读原文：http://www.liankebio.com/AboutShow/articleID/2014120024.html

以下为BioVision试剂盒，通过此链接查询详情：http://www.biovision.com/apoptosis-related-products-483/dna-fragmentation-678/tunel-assays-683/ 目录号 产品名称 规格 特点 应用范围 K401-60 ApoBrdU DNA Fragmentation Assay Kit 60 T 1、简易的技术手段，仅需1h左右2、操作方便快捷、灵敏、稳定3、掺入BrdU（溴代脱氧尿嘧啶核酸），比传统掺入生物素或地高辛标记的脱氧尿嘧啶核酸效率高，检测灵敏度高4、提供包含阳性和阴性质控在内的所有组分5、双色法：FITC检测BrdU的掺入情况，PI用于染细胞核 样本：细胞样本（贴壁、悬浮细胞）、石蜡切片 种属：所有哺乳动物 K402-50 ApoDIRECT DNA Fragmentation Assay Kit 50T 1、步骤简便，仅需1h左右2、快速、方便、灵敏、稳定3、直接掺入FITC-dUTP，无需抗dUTP的抗体，因此可以一步完成，检测迅速 样本：细胞（悬浮或贴壁细胞） 种属：所有哺乳动物 K403-50 ApoBrdU-IHC DNA Fragmentation Assay Kit 50T 1、步骤简便，稳定2、掺入BrdU（溴代脱氧尿嘧啶核酸），比传统掺入生物素或地高辛标记的脱氧尿嘧啶核酸效率高，检测灵敏度高3、提供包含阳性和阴性质控在内的所有组分4、双色免疫组化法：DAB显色掺入的BrdU，甲基绿复染细胞核5、光学显微镜分析（DAB呈棕色，甲基绿呈绿色） 样本： 固定细胞，冰冻、石蜡切片。 种属：所有哺乳动物 K404-60 ApoBrdU Red DNA Fragmentation Kit 60 T 1、步骤简便，仅需1h左右2、快速、方便、灵敏、稳定3、掺入BrdU（溴代脱氧尿嘧啶核酸），比传统掺入生物素或地高辛标记的脱氧尿嘧啶核酸效率高，检测灵敏度高4、提供包含阳性和阴性质控在内的所有组分5、双色法：一种红色荧光染料检测BrdU的掺入情况，7-AAD用于染细胞核 样本： 固定细胞，特别适用于转染GFP（绿色荧光蛋白）的细胞凋亡研究。 种属：所有哺乳动物以下为Life试剂盒，通过此链接查询详情：http://zh.invitrogen.com/search/global/searchAction.action?query=TUNEL&resultsPerPage=15&show_seproductcategorynavigator=true&show_productcategorynavigator=true&show_taxonomynavigator=true&show_brandnavigator=true&show_sedocumenttypenavigator=true&navigator=seproductcategorynavigator&modifier=Cell+Analysis+Kits%2FApoptosis+Kits目录号 产品名称 规格 特点 应用范围 C10245 Click-iT® TUNEL Alexa Fluor® 488 Imaging Assay, for microscopy & HCS 1 kit 1、采用经炔羟修饰的dUTP，比Br-dUTP更小，更容易被TdT掺入2、基于点击（Click）反应，与BrdU抗体（分子量约150kDa）相比，Alexa Fluor叠氮化物的大小仅为1%（分子量＜1000Da），因此只需温和的固定和透化条件，即可实现试剂的渗透 3、相同条件能够检测更高比例的凋亡细胞4、快速，仅需2h5、可利用荧光标记染料同时检测细胞表面和细胞内标记6、双色法：可提供Alexa Fluor488（绿色）、Alexa Fluor594（橙色）、Alexa Fluor647（红色）三种不同标记检测EdU, Hoechst 33342染细胞核 样本：细胞（悬浮或贴壁细胞） 种属：所有哺乳动物 C10246 Click-iT® TUNEL Alexa Fluor® 594 Imaging Assay, for microscopy & HCS 1 kit C10247 Click-iT® TUNEL Alexa Fluor® 647 Imaging Assay, for microscopy & HCS 1 kit KHO1001 APO BrdU (TUNEL) KIT 60 tests 1、提供包含阳性和阴性质控在内的所有组分2、双色法：FITC-PBR-1标记的抗体检测检测BrdU的掺入情况，PI染细胞核 样本：细胞（悬浮或贴壁细胞） 种属：所有哺乳动物 A23210 APO-BrdU? TUNEL Assay Kit - with Alexa Fluor® 488 Anti-BrdU - 60 assays 1 kit 1、提供包含阳性和阴性质控在内的所有组分2、用BrdUTP和末端脱氧核酸转移酶标记羟基末端，用明亮和光稳定的绿色荧光Alexa Fluor488标记的抗BrdU抗体检测BrdU 样本：细胞（悬浮或贴壁细胞） 种属：所有哺乳动物 阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014120023.html

    简  介Propidium iodide（溴化丙锭，以下简称PI）几乎无序列偏好性的通过嵌入碱基对而结合DNA。一般而言，一个染料分子结合4-5个碱基对。但同时PI也可以与RNA结合，这就需要使用核酸酶处理，以区分DNA和RNA染色。PI一旦与核酸结合，其荧光即增强20到30倍，其荧光激发波长改变约~30–40nm而为红色，发射波长改变约15nm为蓝色。虽然其摩尔吸光系数（消光系数）相对较低，若使用合适的光学过滤器，PI表现出一个足够大的Stokes位移能够允许同时检测核DNA和荧光标记抗体。PI可以用荧光显微镜，激光扫描共聚焦显微镜，流式细胞仪和荧光计进行检测。PI可以穿透细胞膜，通常不能通过活细胞细胞膜。PI常用于鉴定死细胞，同时也作为一个复染剂用于多色荧光技术。    PI荧光光谱特性当PI与核酸结合，其荧光最大激发波长为535nm，最大发射波长为617nm（见图1）。PI可被氙气或汞弧灯或与氩离子激光器的488激光所激发。通常情况下，PI在流式细胞仪的FL2通道检测。图 1 PI结合双链DNA后的荧光激发和发射波长    实验材料及方法1、复染贴壁细胞用于荧光显微镜 1.1 实验材料荧光显微镜2X SSC无DNA酶的RNA酶抗淬灭剂，如SlowFade® Gold (S36936) 或ProLong® Gold (P36930)抗淬灭剂1.2 样品制备使用适合您样品的固定步骤。其他染色后，进行PI染色。需要注意的是PI复染需要细胞膜通透。1.3 RNA酶处理若样品经多聚甲醛，甲醛或戊二醛固定，需要经RNA酶处理；若样品经甲醇乙酸或丙酮处理，即不需要RNA酶处理。1.3.1样品使用2X SSC（0.3 M NaCl，0.03 M 柠檬酸钠，pH 7.0）短暂平衡。1.3.2样品在含100μg/ml 无DNA酶的RNA酶的 2X SSC 中孵育 20min， 37℃。1.3.3使用2X SSC润洗样品三次，每次1min。1.4 复染1.4.1 使用2X SSC 平衡样品。1.4.2 使用2X SSC 将1mg/ml（1.5M）PI储液 1:3000 稀释为500nM，通常约300μl足够一个盖玻片染色。使用稀释后的染液覆盖细胞，孵育1-5min。1.4.3 使用2X SSC润洗样品几次。小心吸干玻片上多余的缓冲液，加入适量的抗淬灭剂如Molecular Probes SlowFade® Gold antifade reagent (S36936) 或 ProLong® Gold antifade reagent (P36930)。1.4.4 使用荧光显微镜观察样品。2、复染悬浮细胞用于流式细胞仪2.1 实验材料流式细胞仪PBS乙醇Tris 染色缓冲液（见步骤2.3.1）2.2样本制备使用适合于样品的固定方法，或者使用如下步骤。2.2.1 收集2 × 10^5-1 × 10^6个细胞，离心，弃去上清，轻弹管底以用残余液体重悬细胞，加入1ml PBS（室温）。2.2.2 将细胞悬液缓慢转移至4ml高速震荡的无水乙醇（-20℃）中，孵育5-15min（-20℃）。2.2.3 离心，弃去乙醇，轻弹管子，加入5ml PBS（室温），使细胞水合15min。2.3复染2.3.1 使用染色缓冲液（100 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.1% Nonidet P-40）1:500稀释1 mg/mL (1.5 mM)的PI储液为3 μM溶液，每个样品需1ml。2.3.2 步骤2.2.3的样品离心，弃去上清，轻弹管底，加入1ml PI溶液，室温，孵育15min，然后在流式细胞仪上分析（在染液存在情况下）。如果要使用荧光显微镜观察，需离心，弃去上清，使用新鲜的缓冲液重悬细胞。取一滴细胞悬液于玻片，盖上盖玻片，使用合适的滤光片观察。3、复染样品用于染色体荧光原位杂交技术（以下称染色体FISH）3.1 实验材料荧光显微镜dH2OPBSRNA酶抗淬灭剂（可选）3.2 样品制备根据标准步骤制备样品（见参考文献3,4）。在复染之前，使用去离子水暂短润洗样品，去除残余的盐缓冲液。空气干燥。最后的润洗对于降低非特异性结合有很大帮助。3.3 复染3.3.1 使用PBS 1:1000稀释1 mg/mL (1.5 mM)的PI储液为1.5μM的染色溶液。吸取300μL的染色溶液直接加入样品。如果必要，加入终浓度为10μg/ml的Rnase A（新鲜配制）。使用塑料盖玻片使染液均匀分布。3.3.2 室温，避光孵育30min，或者37℃避光孵育（如加入RNase）。3.3.3 去除盖玻片，使用PBS或去离子水润洗，洗去未结合的染料。3.3.4 用吸水纸小心洗去样品周围残余的液体。盖上玻璃盖玻片，石蜡封片。另外，也可以根据操作手册，加入适量的抗淬灭剂。3.3.5 使用荧光显微镜观察细胞。    参考文献 1. J Mol Biol 13, 269 (1965);  2. Methods Cell Biol 30, 417 (1989);  3. Methods Enzymol 168, 741 (1989);  4. Pardue, M.L. in Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, B.D. Hames and S.J. Higgins, Eds., IRL Press, Oxford, England (1985). 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120022.html

在单抗的生产中，杂交瘤细胞的筛选和鉴定是至关重要的步骤；目前抗体分型产品主要集中于ELISA，多因子检测技术。eBioscience为您提供完全的抗体分型检测产品，让您后续筛选无忧：初筛抗体高分泌性的杂交瘤细胞；鉴定确定阳性克隆细胞的特异性抗体的分型；鉴定抗体重链与轻链的异构体；一、Luminex方法：又称液相悬浮芯片技术，可以实现抗体分型检测更高通量，更高灵敏度，更方便便捷，因此深受研究人员的喜爱。厂商 目录号 产品名称 检测指标 检测方法 eBioscience EPX070-20815-901 ProcartaPlex Mouse Antibody Isotyping Panel (7 plex) IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgE, IgM Luminex eBioscience EPX070-10818-901 ProcartaPlex Human Antibody Isotyping Panel 7plex   Luminex二、ELISA 方法：以其快速、简便、灵敏度高、特异性强、易于标准化等优点得到迅速的发展和广泛应用，现已成为酶免疫测定技术中应用最广的技术。小鼠-Mouse厂商 目录号 产品名称 检测指标 eBioscience 88-50630 Mouse Ig Isotyping ELISA RSG Kit  IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, κ chain, λ chain 88-50660-22 Mouse Ig Isotyping Instant ELISA IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, κ chain, λ chain 88-50450 Mouse IgA ELISA Ready-SET-Go! IgA 88-50400 Mouse IgG total ELISA Ready-SET-Go! IgG(total) 88-50410 Mouse IgG1 ELISA Ready-SET-Go! IgG1 eBioscience 88-50420 Mouse IgG2a ELISA Ready-SET-Go! IgG2a 88-50430 Mouse IgG2b ELISA Ready-SET-Go! IgG2b 88-50670 Mouse IgG2c ELISA Ready-SET-Go!® IgG2c 88-50440 Mouse IgG3 ELISA Ready-SET-Go! IgG3 88-50470 Mouse IgM ELISA Ready-SET-Go! IgM 88-50460 Mouse IgE ELISA Ready-SET-Go! IgE大鼠-Rat： 厂商 目录号 产品名称 检测指标 eBioscience 88-50640 Rat Ig Isotyping ELISA Ready SET Go! IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgA, IgM, κ chain, λ chain 　 88-50650 Rat Ig Isotyping Instant ELISA IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgA, IgM, κ chain, λ chain 　 88-50480 Rat IgA ELISA Ready-SET-Go IgA 　 88-50490 Rat IgG (total) ELISA Ready-SET-Go IgG (total) 　 88-50500 Rat IgG1 ELISA Ready-SET-Go IgG1 　 88-50510 Rat IgG2a ELISA Ready-SET-Go IgG2a 　 88-50520 Rat IgG2b ELISA Ready-SET-Go IgG2b 　 88-50530 Rat IgG2c ELISA Ready-SET-Go IgG2c 　 88-50540 Rat IgM ELISA Ready-SET-Go IgM人-Human 厂商 目录号 产品名称 检测指标 eBioscience BMS2091 Human IgG(total) Platinum ELISA IgG (total) BMS2092 Human IgG1 Platinum ELISA IgG1 BMS2093 Human IgG2 Platinum ELISA IgG2 BMS2094 Human IgG3 Platinum ELISA IgG3 BMS2095 Human IgG4 Platinum ELISA IgG4 BMS2096 Human IgA Platinum ELISA IgA BMS2097 Human IgE Platinum ELISA IgE BMS2098 Human IgM Platinum ELISA IgM 88-50550 Human IgG(total) ELISA Ready-SET-Go!® IgG (total) 88-50560 Human IgG1 ELISA Ready-SET-Go!® IgG1 88-50570 Human IgG2 ELISA Ready-SET-Go!® IgG2 88-50580 Human IgG3 ELISA Ready-SET-Go!® IgG3 88-50590 Human IgG4 ELISA Ready-SET-Go!® IgG4 88-50600 Human IgA ELISA Ready-SET-Go!® IgA 88-50620 Human IgM ELISA Ready-SET-Go!® IgM 88-50610 Human IgE ELISA Ready-SET-Go!® IgE更多相关产品信息, 欢迎致电杭州联科生物技术有限公司400-6721-600； 阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014120021.html

     伯楷安在国际上率先推出高分辨IEF两性电解质载体，主要用于复杂蛋白样品等电聚焦电泳仪IEF分离、双向凝胶电泳2DE分离、蛋白质等电点测定、抗体与单抗体纯度指纹鉴定、重组蛋白质指纹与纯度鉴定、抗生素纯度指纹分析以及乳品蛋白质的指纹分析等。伯楷安载体两性电解质既包括宽跨度pH范围（pH 3-10）也包括一系列窄跨度pH范围产品（详见表）。窄跨度两性电解质在小pH跨度内进一步分离复杂样品，为细微pI值差别的蛋白质提供更好的分离。窄跨度两性电解质系列产品种类丰富，分布在各pH区段，为客户提供了各种选择。伯楷安两性电解质载体特性：   1.分辨率高：可以实现0.4单位的pH Span，对蛋白质等电实现精确测定和高分辨分离2.极端pH梯度：除常规3-10梯度外，能够实现pH2.5-11梯度3.全面兼容：可以与众多公司的电泳装置联用。4.规格齐全：基本覆盖了常用pH规格品种伯楷安两性电解质载体产品表：货号 PH范围 规格 CA-3-5 3-5 10ml CA-3-6 3-6 10ml CA-3-7 3-7 10ml CA-3-10 3-10 10ml CA-4-6 4-6 10ml CA-4-7 4-7 10ml CA-5-7 5-7 10ml CA-5-8 5-8 10ml CA-5-9 5-9 10ml CA-6-7 6-7 10ml CA-6-8 6-8 10ml CA-6-9 6-9 10ml CA-7-9 7-9 10ml CA-8-10 8-10 10ml注：可根据客户要求定制  阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014120020.html

     伯楷安在国际上率先推出高速高分辨IEF IPG胶条，主要用于复杂蛋白样品等电聚焦电泳IEF分离、双向凝胶电泳2DE分离、蛋白质等等电点测定、抗体与单抗纯度指纹鉴定、重组蛋白指纹与纯度鉴定、抗毒素纯度指纹分析等。伯楷安IEF IPG胶条产品优点：1.聚焦迅速：聚焦时间160分钟，比国际同类产品缩短1/3以上2.分辨率高：与国际上主流IPG胶条相比，分辨率为国际2倍以上3.全面兼容：不同型号IEF IPG胶条可与国际各大公司的聚焦电泳设备兼用4.稳定性高： 具有传统IPG IEF的高稳定、高重复性，节省时间及费用伯楷安高速分辨IEF IPG胶条产品表 货号 名称 规格 DH-07-310 DH-IPG预制胶条，PH3-10L，7cm 12根/盒 DH-07-306 DH-IPG预制胶条，PH3-6，7cm 12根/盒 DH-07-407 DH-IPG预制胶条，PH4-7，7cm 12根/盒 DH-07-408 DH-IPG预制胶条，PH4-8，7cm 12根/盒 DH-07-409 DH-IPG预制胶条，PH4-9，7cm 12根/盒 DH-07-508 DH-IPG预制胶条，PH5-8，7cm 12根/盒 DH-07-608 DH-IPG预制胶条，PH6-8，7cm 12根/盒 DH-07-609 DH-IPG预制胶条，PH6-9，7cm 12根/盒 DH-07-710 DH-IPG预制胶条，PH7-10，7cm 12根/盒 DH-07-310N DH-IPG预制胶条，PH3-10NL，7cm 12根/盒注：伯楷安另可提供11cm，13cm,17cm,18cm,24cm型号的DH-IPG胶条。注意事项：①IPG胶条将pH梯度固定在一根易于操作的胶条上，简化了第一向电泳分离。②IPG胶条由高纯度IPG单体制备而成，并经过充分的质量和性能测试以确保双向电泳结果的重复性。③IPG胶条有多种规格，可提供多种pH梯度选择，并且每一种类均有6种不同的胶条长度。④短胶条适用于方法优化，而长胶条则能予以最好的蛋白分辨率和更高的上样量。⑤IPG胶条实验时，配合用的其它化学试剂纯度要高，至少是分析级。⑥IPG胶条实验时，使用去离子水（电导2μS）。⑦IPG胶条储放条件为-20℃。 阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014120019.html

     SDS-PAGE电泳技术广泛应用于生物学、医学、环境学、食品科学和生化药品等的蛋白质分离和日常鉴定分析。预制胶解决了传统制胶的许多问题：耗时长、毒性大、稳定性差等。伯楷安高品质SDS-PAGE预制胶效果图：伯楷安预制胶特点： 快速电泳，电泳整个过程只要40分钟，较国际同类产品提供40%以上分辨率高：预制胶分离条带窄，锐度好，分辨率较国际同类产品高，满足高分辨分离的要求全面兼容：可以与众多国内外公司的电泳装置兼容重现性好：产品来自大罐装精确配置，结果可靠伯楷安预制胶产品列表：货号 名称 规格 SW-08 8%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-10 10%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-12 12%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-15 15%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-18 18%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-4-10 4-10%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-4-12 4-12%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-4-15 4-15%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-4-18 4-18%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-4-20 4-20%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-5-10 5-10%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-5-12 5-12%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-5-15 5-15%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-5-18 5-18%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-5-20 5-20%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-8-15 8-15%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-8-20 8-20%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒 SW-10-20 10-20%SDS-PAGE 预制胶，Well孔 10片/盒注：可根据客户要求定制注意事项①本预制胶通过pH中性缓冲液制备，可长期存放（室温6个月，4℃一年），电泳及转膜缓冲液兼容传统低成本的tris-glycine缓冲液，35-40分钟即可完成电泳，质量稳定，即开即用。目前多种胶浓度及梯度胶供您选择，也可以根据客户不同客户不同需要进行定制。②电泳及电转缓冲液建议使用新配置的缓冲液，试剂纯度不够，反复使用或长期放置过的缓冲液会降低电泳效果。如果自配的缓冲液不理想，可直接购买上海伯楷安电泳电转通用缓冲液。③电泳前请务必撕去预制胶板底端的封口粘膜。④拨掉梳子后，如果偶尔出现胶齿不直的情况，可用注射器针头将胶齿拨正。 阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014120018.html

       CIK（Cytokine Induced Killer）【背景知识】 CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞优势：杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。 【培养原理】CIK培养用细胞因子和抗体：1. CD3激发型单抗：T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成 TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或 CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或 MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-γ等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致 T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起 T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的 CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的 T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的 T细胞均能被激活。2. IL-2 (白细胞介素-2)IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。3. IFN-γ(干扰素-γ)IFN-γ具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-γ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-γ加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-γ，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。4. IL-1α(白细胞介素-1α)IL-1α也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1α与IFN-γ和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK的细胞毒作用。【细胞制备】1．外周血单个核细胞的采集1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；1.3 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。2．CIK细胞的培养及鉴定2.1 将PBMC按1-2x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml的重组人IFN-γ，37oC，5%CO2培养箱中培养；2.2 24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300 U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1α。2.3每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；2.4在培养的第14d，收获CIK细胞。2.5 CIK细胞质控：2.5.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；2.5.2 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。2.5.3 细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10:1(数目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200μl，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。2.5.4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素【步骤简图】【推荐试剂】 生产商 产品名称 产品编号 产品规格 使用浓度 eBioscience Anti-Human CD3 Functional Grade Purified 16-0037-85 500μg   PeproTech- biogems Anti-Human CD3 SAFIRE Purified 05121-25 100μg/500μg   PeproTech 重组人IFN-γ (Animal Free) AF-300-02 100μg/250μg/500μg/1mg 50ng/ml PeproTech 重组人IL-1α (Animal Free) AF-200-01A 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg 0.1ng/ml PeproTech 重组人IL-2 (Animal Free) AF-200-02 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 30ng/ml注：Animal Free意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子。生产商 产品名称 产品编号 产品规格 PeproTech 重组人Flt-3 Ligand    (Animal Free) AF-300-19 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg PeproTech 重组人IL-7  (Animal Free) AF-200-07 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg PeproTech 重组人IL-15  (Animal Free) AF-200-15 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg PeproTech 重组人SCF  (Animal Free) AF-300-07 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg【参考文献】[1] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133DC-CIK【背景知识】DC是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家Ralph M. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Na?ve T cells)增殖的APC，成熟的DC可以通过Ⅱ型组织相容性抗原（MHC-Ⅱ）等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。DC-CIK (或DC+CIK)[1]是指与DC细胞共培养的CIK细胞，也可以说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。CIK细胞和DC细胞是细胞免疫治疗的2个重要组成部分，两者联合可确保高效的免疫反应。【培养原理】1．DC培养用细胞因子：1.1 GM-CSF(粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。 1.2 IL-4 (白细胞介素-4)IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，但不表达CD14。1.3 TNF-α (肿瘤坏死因子-α)TNF-α可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。2. CIK培养用细胞因子和抗体（同上）【细胞制备】1．外周血单个核细胞的采集1.1用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80-100mL；1.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；1.3无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的 PBMC，细胞数量需达到1-3x108。2．(可选步骤) 肿瘤抗原的制备用于负载 DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。用TSA或 TAA负载的DC具有很好的靶向性，但该方法具有已确定的肿瘤特异性抗原或抗原肽种类少和单一抗原的免疫攻击经常无法杀伤肿瘤细胞等缺陷。而用肿瘤全细胞抗原负载DC可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。    反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：2.1手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；2.2无菌生理盐水洗3次；2.3用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；2.4 200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；2.5用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；2.6将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复 3-5 次；注：也可以-80℃/37℃ 反复冻融3-5次。2.7将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；2.8收取上清，0.22μm 滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；2.9 -80oC保存备用。3. CIK 细胞的培养及鉴定3.1 步骤1中获得的PBMC用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；3.2 37℃，5%CO2 培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；3.3 收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至 1-2 x 106/ml；3.4 加入1,000 U/ml 的重组人IFN-γ培养；3.5 24h 后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300 U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1。3.6 每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；3.7 在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x109个以上。3.8 CIK细胞质控：3.8.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；3.8.2 用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明显提高。4．DC 细胞的培养及鉴定4.1 步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是 CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；4.2 每3d半量换液一次，并补足细胞因子；4.3 (可选步骤) 在培养的第5d，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50μg/ml，对DC进行抗原负载；注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。4.4在培养的第6d，加入重组人TNF-γ(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；4.5在培养的第7d或第8d，收获DC细胞，其数量应达到1×106个以上；4.6 DC的质检：4.6.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；4.6.2 流式细胞仪检测DC细胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表达，以确定DC 是否成熟。5. DC-CIK 细胞的制备和质检5.1 收集步骤4和步骤3中所获得的DC细胞和CIK细胞，按1:10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2 (300 U/ml)；5.2 每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)；5.3 在第7d收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；5.4 DC-CIK细胞的质检：5.4.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；5.4.2 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。5.4.3 细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10:1(数目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1x104个，终体积为200μl，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。5.4.4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素【步骤简图】【推荐试剂】 生产商 产品名称 产品编号 产品规格 使用浓度 eBioscience Anti-Human CD3 Functional Grade Purified 16-0037-85 500μg   PeproTech- biogems Anti-Human CD3 SAFIRE Purified 05121-25 100μg/500μg   PeproTech 重组人 GM-CSF (Animal Free) AF-300-03 20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 50-100ng/ml PeproTech 重组人 IFN-γ (Animal Free) AF-300-02 100μg/250μg/500μg/1mg 50ng/ml PeproTech 重组人 IL-1α (Animal Free) AF-200-01A 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg 0.1ng/ml PeproTech 重组人 IL-2 (Animal Free) AF-200-02 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 30ng/ml PeproTech 重组人 IL-4 (Animal Free) AF-200-04 20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 100ng/ml注：Animal Free 意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子。【其它相关试剂】生产商 产品名称 产品编号 产品规格 PeproTech 重组人 Flt-3 Ligand (Animal Free) AF-300-19 10μg/50μg /100μg /250μg /500μg /1mg PeproTech 重组人 IL-7   (Animal Free) AF-200-07 10μg /100μg /250μg /500μg /1mg PeproTech 重组人 IL-15  (Animal Free) AF-200-15 10μg /100μg /250μg /500μg /1mg PeproTech 重组人 SCF   (Animal Free) AF-300-07 10μg /50μg /100μg /250μg /500μg /1mg【参考文献】[1] Steinman RM, Cohn ZA. "Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution". J. Exp. Med. 1973; 137 (5):1142–62.[2] 张志伟，宋鑫。DC-CIK细胞临床制备规范化研究。中国肿瘤，2011；20(2)：85-88。[3] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133.CIK/DC在细胞治疗中的应用一、高效CIK 高效CIK（High-efficiency cytokine-induced killer），即高效细胞因子诱导的杀伤细胞，是治疗肿瘤和慢性传染性病毒感染的细胞免疫治疗方法之一。其技术是从患者自体外周血（20～100ml）中分离单个核细胞，经过体外刺激扩增培养，使在生理条件下具有杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤性效应的细胞亚群，主要是CD8＋杀伤性T淋巴细胞（CTL，约70%）和自然杀伤细胞（NK，约10%）得到大量的扩增和活化，之后经一次或多次回输给患者。高效CIK作为细胞过继性免疫治疗方法，可有效辅助恶性肿瘤和慢性传染性病毒感染的治疗。1. 高效CIK治疗适应症（一）确诊为恶性肿瘤或EBV、CMV、HPV、HBV、HCV病毒感染；（二）预期生存期＞3个月的患者； （三）实验室检查必须符合下列条件：淋巴细胞绝对值＞0.8×109/L；（四）病人有自知能力，能签署知情或志愿同意书；（五）患者依从性较好，能配合针对毒副反应的治疗；（六）抗HIV（－），TPHA（－）；2. 高效CIK治疗禁忌症（一）合并颅内高压或意识不清的颅脑肿瘤；（二）症状性心衰或严重心律失常；（三）弥漫性血管性内凝血；（四）血清肌酐和/或尿素氮≥正常值的1.5倍；（五）败血症或其他难以控制的感染；（六）肠梗阻；（七）经治疗后心脏病情仍不稳定，入组前1个月内出现过心肌梗塞；（八）有症状的周围神经病变＞2级（NCIC-CTG标准）；（九）不可控制的糖尿病；（十）严重精神紊乱；（十一）双磷酸盐难以控制的高钙血症，血钙浓度＞12mg/100ml；（十二）妊娠及哺乳期妇女；（十三）合并传染性疾病：艾滋病、梅毒等；（十四）T淋巴细胞相关性淋巴瘤和白血病患者；（十五）有严重的T淋巴细胞相关自身免疫病的患者；（十六）因感染引起的发热患者；3. 高效CIK的治疗方案（一）单独使用适用人群 预期效果 使用方案 手术后无其他治疗患者 预防复发和转移 ?第一阶段每周1次回输，共4-6次回输； ?第二阶段每2周1次回输，共4-6次回输； ?此后可每3个月至半年进行每周1次×4次回输； 所有其他治疗无效肿瘤持续进展的患者 改善生活质量稳定肿瘤 ?1周1次回输，共6-8次回输后评价疗效； ?如患者要求，根据病情进展可持续进行每1-2周1次的回输；   化疗或放疗有效但已停用，需维持治疗效果的患者 长期维持肿瘤稳定 ?患者无肿瘤o同手术后无其他治疗患者方案；?患者体内仍有肿瘤 o第一阶段每周1次回输，共4-6次回输； o第二阶段每2周1次回输，共4次回输； o根据患者的要求，可长期进行每2周1次的回；（二）与化疗联合使用适用人群 预期效果 使用方案 正在进行化疗（静脉给药）的患者（口服化疗药同单独使用高效CIK治疗方案） 改善生活质量，消除化疗副作用，与化疗产生协同作用，杀伤肿瘤细胞维持肿瘤稳定。 ?三周化疗方案 o化疗静脉给药结束后48小时回输、第9天回输； o自第一天给与化疗计算，第7天、第14天回输；?四周化疗方案 o化疗第7天和第17天各回输1次；?8天化疗，三周方案 o化疗第3天、第10天回输；（三）与靶向治疗联合使用适用人群 预期效果 使用方案 正在进行靶向治疗的患者 通过ADCC作用与抗体类靶向治疗产生协同作用，杀伤肿瘤改善靶向药物引起的副作用维持肿瘤稳定。 ?根据靶向药物的治疗方案而定 o细胞回输通常在每次靶向药物给药后48小时； o靶向治疗结束后高效CIK治疗方案参考单独使用方案；4. 高效CIK血标本采集护理（一）采血前做好患者的评估，包括病情、意识状态、生命体征、正在进行的治疗、静脉充盈情况、患者的理解及合作能力；（二）两人核对患者的床号、姓名、住院号、采血时间、采血量等；（三）告诉患者采血的目的和方法，让患者放松情绪，避免紧张；（四）采血时协助患者取平卧位或坐位，暴露静脉，选择粗、直、大静脉，严格无菌操作采集血标本；（五）采血过程中注意观察患者面色、神志，询问患者有无头晕、心慌等不适，如患者有头晕、乏力、心悸不适等情况即停止采血，报告医生，协助处理，采血完成按压穿刺点10min；（六）将盛装血标本试管轻柔180°颠倒摇匀5～8次，以达到更好的抗凝效果，然后将血标本装于密封袋，贴上封条，存放于血样箱（温度4～8℃）立即送细胞实验室进行培养；（七）填写细胞培养血标本采集护理记录单。5. 高效CIK血样本采集注意事项（一）采血前，患者可以饮温开水、低脂清淡饮食；（二）采血前，不可以进行任何输液治疗；（三）采血前1天，患者不可以进行可能损伤、破坏淋巴细胞的治疗和检查项目，如放疗、化疗、核医学检查等；（四）连续两个疗程治疗时，取血和回输细胞在时间上会有交叉，取血必须在细胞回输之前；（五）3天内的血常规，要求白细胞在正常范围，淋巴细胞绝对值大于0.8×109/L；（六)采血量取决于患者淋巴细胞绝对数，采血量ml×淋巴细胞计数>0.8×109/L，约为20-100ml；（七）如需冻存细胞，采血量需要增加；（八）血标本采集后，置入4～8℃无菌运转箱由专人及时送至实验室，一般标本放置时间不能超过4h。6.高效CIK回输护理（一）心理护理，如客观讲解CIK的疗效及可能出现的副作用，消除患者及家属的疑惑和恐惧心理，取得配合。细胞治疗作为一种新疗法给肿瘤患者带来希望，但其疗效存在个体差异，应让患者和家属充分知情，可避免患者因不能达到预期的疗效而出现心理落差；（二）确定回输时间，通知患者，根据治疗需要合理安排回输工作；（三）CIK细胞送到病房，护士应与实验员核对病人姓名、住院号、CIK编号、制备日期、回输日期、包装是否完整、细胞质量检测结果等；（四）经外周静脉给患者回输，严格无菌操作，注意调节滴速，先慢后快；同时注意密切观察患者的一般情况，如体温、脉搏、呼吸、血压等，输注细胞前后均使用生理盐水冲管；（五）输注过程中，密切巡视，5～10min轻轻挤压传输袋底部，使沉淀细胞重新悬浮，以免细胞沉淀聚集；（六）副作用的观察及护理1）发热，CIK最常见副作用为发热，常在回输后1-2h内发生，也有病人在回输4h之后发生发热反应。发生发热反应首先向医生汇报。一般情况，低、中度发热时可不作特殊处理，嘱患者多饮水；高热时按医嘱冰敷等物理降温或口服退热药物；患者寒战时注意观察病情变化，做好保暖，必要时给予吸氧；2）变态反应，患者出现皮疹、呼吸困难、心悸等反应，临床上极少见此类反应，若出现变态反应立即停止输注，通知医生，给予吸氧、抗过敏处理；（七）回输完毕，嘱门诊病人常规留观30min, 如有不适及时告知护士；嘱患者离院后如有病情变化，及时复诊；（八）观察记录病人情况，填写细胞回输护理记录单。7. 高效CIK回输注意事项（一）输注细胞前必须经过两人核对无误，方可输入；（二）认真检查细胞质量，查看细胞检测报告；（三）使用一次性输血管，禁止使用带精密过滤器的输液管；使用7号或以上的头皮针，避免小针头产生的剪切力对细胞的损害；（四）禁止在细胞内加入其它药物；（五）注意输注速度，起始速度30～40滴/min，观察10min后如没有特殊反应，将滴速改为60～80滴/min，40～60分钟内输完；（六）细胞培养后要及时回输，需要保存时必须放冰箱2～8℃保存不超过8h；（七）放疗、化疗前后需间隔48小时以上方可进行细胞回输，防止放疗、化疗杀伤CIK细胞，影响疗效。二、DC-CIK随着细胞制备技术的日趋完善，DC-CIK细胞过继免疫治疗在临床逐渐开展，相关报道可见。实验研究方面，Marten实验研究表明：DC和CIK共培养可以同时促进CIK细胞和DC细胞的增殖和免疫功能。张嵩等的动物实验研究表明：化疗后应用DC-CIK细胞可有效抑制肿瘤细胞生长，甚至使肿瘤完全消失；而且DC-CIK细胞的抗肿瘤效应对集体免疫系统功能不产生危害，在当前对肿瘤特异性抗原了解相对较少的情况下，应用DC-CIK细胞作为肿瘤放化疗和手术后的辅助治疗有重要的临床意义。 1. 在白血病中的应用赵春华等研究表明：与DC共培养可使CIK细胞获得更高的增殖速率和更强的体内外抗肿瘤活性，DC-CIK细胞可以作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略。童春容等临床研究显示：DC-CIK细胞治疗具有明显清除微小残留白血病细胞防止复发的作用，并且静脉输注安全。 2. 在肿瘤中的应用将CIK细胞和同源DC细胞共培养后即可获得DC-CIK细胞。它既可促进DC细胞的成熟，更能促进ClK的增殖，并加强其抗肿瘤活性。DC细胞是机体免疫应答的始动者，能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应；CIK细胞可通过非特异性免疫杀伤作用清除肿瘤患者体内微小残余病灶，所以负载肿瘤抗原的DC与CIK的有机结合（即DC-CIK细胞）能产生特异性和非特异性的双重抗肿瘤效应。三、DC治疗对肿瘤治疗的原理①DC可以高表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，MHC分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽-MHC分子复合物，并递呈给T细胞，从而启动MHC-I类限制性CTL反应和MHC-Ⅱ类限制性的CD4+ Thl反应。同时，DC还通过其高表达的共刺激分子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等)提供T细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答。②DC与T细胞结合可大量分泌IL-12、IL-18激活T细胞增殖，诱导CTL生成，主导Th1型免疫应答，利于肿瘤清除；激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用；③DC分泌趋化因子(Chemotactic Cytokines， CCK)专一趋化初始型T细胞促进T细胞聚集，增强了T细胞的激发。保持效应T细胞在肿瘤部位长期存在，可能通过释放某些抗血管生成物质(如IL-12、IFN-γ)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。上述CCK进一步以正反馈旁分泌的方式活化DC，上调IL-12及CD80、CD86的表达；同时DC也直接向CD8+T细胞呈递抗原肽，在活化的CD4+ T细胞辅助下使CD8+ T细胞活化，CD4+和CD8+T细胞还可以进一步通过分泌细胞因子或直接杀伤，增强机体抗肿瘤免疫应答。四、ACTL全称“ AAV-DC-CTL靶向性抗肿瘤细胞免疫技术”，简称“ACTL?”或“ACTL技术”或“ACTL肿瘤细胞靶向治疗”。"ACTL? Anti-Cancer Cellular Immunotherapy" 1. ACTL技术背景2011年10月3日，加拿大科学家、美国医学会和美国国家科学院院士拉尔夫?斯坦曼（Steinman）教授获得2011年诺贝尔医学奖。斯坦曼获奖的原因在于他在“树突状细胞（Dendritic Cell, DC细胞）及其在适应性免疫系统方面作用的发现”。21世纪初，美国斯坦福大学医学院肿瘤中心刘勇教授在斯坦曼教授的指引下将其研究的以重组腺相关病毒(Recombinant Adeno-associated Virus, rAAV)与斯坦曼教授研究的DC细胞相结合，研发以携带某种或数种特定肿瘤相关抗原决定簇基因的重组腺相关病毒转染DC细胞，在体外刺激患者T淋巴细胞，产生特异性杀伤某种或数种肿瘤相关抗原阳性肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic Lymphocyte, CTL细胞），随后进行相关的临床试验研究，获得成功。此治疗技术称为ACTL肿瘤细胞靶向治疗技术，已获得5项国际专利保护，由此技术制备的特异性杀伤肿瘤相关抗原阳性肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞称为特异杀伤性T细胞（ACTL，A代表特异性抗原）具有高效性、靶向性（即特异性）杀伤某种或数种特定肿瘤相关抗原阳性肿瘤细胞以及PSMA 阳性的肿瘤新生血管内皮细胞的强大功能，对正常细胞无损伤作用。ACTL肿瘤细胞靶向治疗技术临床应用的典型例子为斯坦曼教授自身晚期胰腺癌的治疗和苹果公司乔布斯晚期胰腺癌的治疗。拉尔夫?斯坦曼（Steinman）教授仅采用了此治疗技术，生存时间为4年。在斯坦福大学肿瘤中心，经过数年的临床研究，于2010年证明了ACTL特异杀伤性T细胞不仅能够直接靶向杀伤肿瘤细胞，而且可封闭肿瘤新生血管，发挥间接杀伤肿瘤细胞作用，明显提升临床疗效。此项研究成果被2010年美国肿瘤临床学会(ASCO)评为2010年度上半年肿瘤生物治疗领域最重要的突破。在美国进行的临床研究表明，ACTL特异杀伤性T细胞不仅有可能逆转妇科和前列腺等恶性肿瘤对抗激素治疗产生的耐药性，而且有可能逆转肿瘤细胞对易_瑞_沙、阿_瓦_斯_丁等分子靶向药物治疗的耐药性。 2. ACTL技术治疗机理AAV-DC-CTL?肿瘤细胞靶向治疗技术是将无致病性的野生型腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV) 通过基因重组技术改建为携带特定肿瘤相关抗原决定簇基因的重组腺相关病毒，感染患者的外周血单核细胞 (Monocytes. Mo)，经细胞因子诱导，单核细胞转化为具有强大抗原提呈功能的DC细胞。经此技术获得的DC细胞在体外刺激患者的T淋巴细胞，产生有效杀伤肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicT lymphocytes, CTL)。所产生的CTL 具有肿瘤抗原特异性，即靶向性，仅针对某种或数种特定肿瘤相关抗原阳性的肿瘤细胞以及PSMA 阳性的肿瘤新生血管内皮细胞具有杀伤作用，对抗原阴性的细胞无任何作用。CTL细胞是CD8+的T细胞亚群，为一种特异T细胞，对某些病毒、肿瘤细胞等具有直接杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤的重要防线。CTL杀伤机制有：①释放穿孔素，颗粒酶，裂解靶细胞。②通过FasL介导靶细胞的凋亡。推荐产品及相关产品汇总表： 一、CIK生产商 产品名称 产品编号 产品规格 使用浓度 推荐产品 eBioscience Anti-Human CD3 Functional Grade Purified 16-0037-85 500μg    PeproTech- biogems Anti-Human CD3 SAFIRE Purified 05121-25 100μg/500μg   PeproTech 重组人IFN-γ (AF) AF-300-02 100μg/250μg/500μg/1mg 50ng/ml PeproTech 重组人IL-1α(AF) AF-200-01A 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg 0.1ng/ml PeproTech 重组人IL-2 (AF) AF-200-02 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 30ng/ml 相关产品 PeproTech 重组人Flt-3 Ligand    (AF) AF-300-19 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg   PeproTech 重组人IL-7 (AF) AF-200-07 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg   PeproTech 重组人IL-15 (AF) AF-200-15 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg   PeproTech 重组人SCF (AF) AF-300-07 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg  二、 DC-CIK 生产商 产品名称 产品编号 产品规格 使用浓度 推荐产品 eBioscience Anti-Human CD3 Functional Grade Purified 16-0037-85 500μg   PeproTech- biogems Anti-Human CD3 SAFIRE Purified 05121-25 100μg/500μg   PeproTech 重组人 GM-CSF (AF) AF-300-03 20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 50-100ng/ml PeproTech 重组人 IFN-γ(AF) AF-300-02 100μg/250μg/500μg/1mg 50ng/ml PeproTech 重组人 IL-1α(AF) AF-200-01A 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg 0.1ng/ml PeproTech 重组人 IL-2 (AF) AF-200-02 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 30ng/ml PeproTech 重组人 IL-4 (AF) AF-200-04 20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 100ng/ml 相关产品 PeproTech 重组人Flt-3 Ligand    (AF) AF-300-19 10μg/50μg /100μg /250μg /500μg /1mg   PeproTech 重组人 IL-7 (AF) AF-200-07 10μg /100μg /250μg /500μg /1mg   PeproTech 重组人 IL-15 (AF) AF-200-15 10μg /100μg /250μg /500μg /1mg   PeproTech 重组人 SCF (AF) AF-300-07 10μg /50μg /100μg /250μg /500μg /1mg    阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120017.html

     联科生物SunnyELISA新推出Human IL-15、IL-29、 CCL3(MIP-1alpha)、CCL4(MIP-1beta)、GM-CSF、Granzyme K ELISA检测试剂盒，品质保证，灵敏度达到0.21 U/ml，平均回收率为102%，板内和板间变异系数均在8%，专业的代测服务和完美的检测报告为您提供真实的数据、节省宝贵的精力。 指标名 灵敏度 平均回收率 IL-15 3.78 pg/ml 97% IL-29 0.12 pg/ml 93% CCL3/MIP-1alpha 7.15 pg/ml 94% CCL4/MIP-1beta 3.58 pg/ml 99% Granzyme K 2.41 pg/ml 100% TSLP 0.13 pg/ml 100%IL-15与IL-2结构相似。病毒感染后，单核吞噬细胞会分泌IL-15。 IL-15可以诱导自然杀伤细胞的分化。IL-29是III型干扰素，又称为IFN-λ1，与IL-28非常相似。IL-29在宿主抵御微生物的免疫反应中起重要作用，同时，在病毒感染的样本中，IL-29上调表达。目前小鼠基因组中没有发现IL-29基因。TSLP即胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin)。TSLP在抗原递呈细胞活化，促进T细胞分群的过程中起关键作用。GM-CSF（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)）粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，又称为集落刺激因子2（colony stimulating factor 2 (CSF2)），可由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、NK细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌产生。GM-CSF可以刺激干细胞分化成粒细胞（嗜酸性、嗜碱性、中性粒细胞）、单核细胞。Granzyme 颗粒酶是细胞毒性T细胞和自然杀伤性细胞中的胞质颗粒释放的丝氨酸蛋白酶。颗粒酶可以诱导目标细胞的程序性死亡，从而消除被细菌或病毒感染的细胞。MIP-1alpha 与MIP-1beta，巨噬细胞炎症蛋白，都是半胱氨酸-半胱氨酸家族的趋化因子。他们不仅是化学诱导物，而且还是巨噬细胞辅助活化因子。新品列表：目录号 产品名称 规格 70-E-EK1151 Human IL-15 ELISA Kit 48T 70-E-EK1152 Human IL-15 ELISA Kit 96T 70-E-EK115S Human IL-15 Standard  2 ng/vial 70-E-EK1611 Human CCL3 (MIP-1 alpha) ELISA Kit 48T 70-E-EK1612 Human CCL3 (MIP-1 alpha) ELISA Kit 96T 70-E-EK161S Human CCL3 (MIP-1 alpha) Standard 2 ng/vial 70-E-EK1621 Human CCL4 (MIP-1 beta) ELISA Kit 48T 70-E-EK1622 Human CCL4 (MIP-1 beta) ELISA Kit 96T 70-E-EK162S Human CCL4 (MIP-1 beta) Standard 0.75 ng/vial 70-E-EK1631 Human GM-CSF ELISA Kit 48T 70-E-EK1632 Human GM-CSF ELISA Kit 96T 70-E-EK163S Human GM-CSF Standard 0.375 ng/vial 70-E-EK1641 Human Granzyme K ELISA Kit 48T 70-E-EK1642 Human Granzyme K ELISA Kit 96T 70-E-EK164S Human Granzyme K Standard 1 ng/vial 70-E-EK1291 Human IL-29 ELISA Kit 48T 70-E-EK1292 Human IL-29 ELISA Kit 96T 70-E-EK129S Human IL-29 Standard  1ng/vial 70-E-EK1651 Human TSLP ELISA Kit 48T 70-E-EK1652 Human TSLP ELISA Kit 96T 70-E-EK165S Human TSLP Standard 1ng/vial以上新品现货供应，欢迎广大科研工作者选购品质卓越的民族生物试剂。 阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014120016.html

小鼠移植瘤实验已经被广泛应用于生命科学研究的多个方面，如药物研发、肿瘤干细胞研究、肿瘤血管生成及肿瘤转移预测研究等。人的肿瘤细胞在小鼠体内增殖形成移植瘤的过程中，鼠源细胞会随着血管生成等过程不断渗透如移植瘤中，包括淋巴细胞亚群、成纤维细胞和内皮细胞等。鼠源细胞渗透的程度与多种因素有关，如肿瘤细胞类型、细胞增殖速度及接种位置等，都有关系，但是明确的是，鼠源细胞肯定会渗透其中。鼠源细胞的掺入对后续针对肿瘤细胞特性的研究会造成严重干扰：在细胞培养过程中，鼠源的成纤维细胞生长过快，严重影响人源肿瘤细胞的生长；另外，在分子生物学分析，如基因芯片分析中，鼠源的基因可能会与人的探结合，从而竞争探针，降低实验的灵敏度。因此，为了能得到更可靠的实验结果，最好将鼠源细胞去除后再研究移植瘤中的肿瘤细胞的特性及功能。现在，Miltenyi新推出一款去除移植瘤中鼠源细胞的试剂盒—mouse cell depletion kit(130-104-694)，这是目前市面上唯一一款可以达到该目的的产品，而且经验证，效果非常好。图1：CD326+的结肠癌细胞在小鼠体内形成的移植瘤。用gentleMACS组织处理器解离移植瘤后，用mouse cell deleptionkit进行鼠源细胞的去除，去除前后用流式检测，抗体使用CD326-PE和磁珠结合细胞检测抗体-APC。  图2：鼠源细胞去除前后的细胞进行培养3天，固定后用小鼠肌动蛋白（红）和人CD326（绿）染色，细胞核用DAPI（蓝）标定。 阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014120015.html

1、Western用的一抗，单抗好些还是多抗好些？做Western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少，一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于Western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于Western的抗体识别的是氨基酸序列特异性，而可用于ELISA的抗体要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构象特异性，所以一般根据说明书来确定。做免疫印迹选择抗体主要考虑两个问题，一时所选抗体是否识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。2、半干转是否要去膜、滤纸、胶同样大小，因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层滤纸也不能因过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干转是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。 3、Western Blot哪种染色好？阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达1.5ug，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。胶体金，灵敏度高，检测范围可达到pg级，但染色稳定。 生物素话灵敏度位于1.2之间，可用于任何一种膜。 4、不能很好的将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么解决？可以考虑，转移缓冲液中加入20%甲醇，因为甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液中加入终浓度0.1% SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜，低浓度胶，提高转移电压/电流，增加转移时间。 5、DAB显色，碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么。DAB显色在辣根过氧化物酶的作用能形成一种灰褐色的终末产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，DAB的氧化还能引起聚合作用，导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120014.html

1、Western实验中，使用TBS和PBS的区别。选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性很重要。PBS的缓冲能力强于TBS，TBS在pH7.0以下缓冲能力较弱。一般根据实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液首选PBS。Western blot中使用PBS和TBS均可，根据需要选择合适的浓度。2、没有注明可以用来做Western blot的一抗，可以用来做Western blot吗？ 不一定，因为有的抗体是识别线性表位的，有的是识别构象型表位，识别构象型表位的抗体不能用于Western blot，因为在Western blot中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。 3、做Western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗吗？最好不要同时加两种一抗，因为如果结果里面有非特异性信号的话，就说不清楚。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗、ECL显色、压片、洗片，漂洗后加内对照的一抗、二抗、ECL显色、压片，洗片。 4、Western blot使用哪种膜好，PVDF膜还是NC膜。可以考虑，转移缓冲液中加入20%甲醇，因为甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液中加入终浓度0.1% SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜，低浓度胶，提高转移电压/电流，增加转移时间。 5、为什么出现多条带，每个加样槽中都出现了多条带，而且好像都很有规律，为什么？是封闭时间不够吗？做Western必须要内参吗？ 一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致，这样才有说服力。表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或人为造成目的条带浓度的变化，严格意义上讲，内参是必须的。 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120013.html

科学家发现小鼠和人类多种组织间存在惊人的基因表达差异，此研究于11月17日发表于PNAS期刊。斯坦福大学Michael Snyder和他的同事比较了15种人和小鼠的组织，包括脑，心脏，肝，肾等。他们发现基因表达模式因物种不同而非组织。这与先前一些研究人和小鼠组织基因表达差异的研究是对立的，例如，之前认为人和小鼠肝脏的基因表达比小鼠的肝脏和大脑更相似。这些组织特异性基因表达模式可能已经出现，因为包括肾，脑，肝和肌肉等所有测试的组织都是功能特异性的，在两个物种中功能相同。Snyder说这些实验中高特异性组织的数量限制可能隐藏了种属特异性模式。Snyder和他的同事发现人和小鼠组织中4000个基因的表达差异，也发现了表观遗传学上的变化，当基因在其中一种物种中更高表达时，两个组蛋白H3K4me3 和H3K27ac活性更强。延伸到非编码RNA，团队发现组织间转录水平比编码蛋白的基因表现出更大的差异性。http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/41453/title/Species-Specific/ 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120012.html

根据11月19日发表在nature杂志上的研究：一种小鼠诺瓦克病毒似乎恢复了在无菌或抗生素处理小鼠的内脏中的共生细菌的一些功能。纽约大学史葛柏生物分子医学研究所Ken Cadwell和他的同事发现小鼠诺瓦克病毒murine norovirus (MNV)感染无菌和抗生素处理小鼠能帮助修复缺少细菌的肠内部的形态缺陷，并且提高免疫细胞和信号分子的生产。http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/41475/title/Virus-Protects-Mouse-Gut/ 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120011.html

     一只怀孕小鼠肠道中的细菌可以加强她发育中胎儿的血脑屏障。      根据11月19日发表于Science Translational Medicine期刊上的一篇文章指出，正是由于肠道中的一些存储物，尤其是居住的细菌，才使小鼠在出生前后的大脑不透水层正当发育。      瑞典卡罗林斯卡研究院Sven Pettersson小组比较了无菌怀孕小鼠和有正常微生物的怀孕小鼠间的血脑屏障（BBB）发育，正如所料，带有正常菌群的小鼠直到胎儿发育末期仍表现出正常的BBB门襟。该小组利用了一种可追踪抗体，此抗体容易在早期胎儿大脑中检测到，后来就被血管限制了。而无菌怀孕小鼠的胎儿，即使是在妊娠后期此抗体也能继续进入大脑组织。http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/41476/title/Mother-s-Microbes-Protect-Baby-s-Brain/ 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120010.html

      一种微流体设备能够安全的在几分钟内将解冻的红细胞中的甘油移除，可能会使冻存血更适合于平时的输血。      2014年10月28日，俄勒冈州大学生物工程师Ratih Lusianti 和Adam Higgins报道了用一种微流体装置可以将甘油去除过程从一个小时降到三分钟。      该微流体装置具有一对50或130微米宽的微通道，被用于肾透析相同类型的膜分开。红细胞，在40%的甘油溶液中进行，以约4cm/s的速度泵入其中一个通道。在细胞膜另一侧的微通道填充了5%的生理盐水，会逐渐下降到0.9%。      为了能得到一个典型的输血流速4ml/min，将约需要480个平行微通道。Higgins和他的同事们计划跟专业从事排列微流体的工程师一起合作来设计一种升级装备。另一个需要注意的问题是从系统中准确移除受损血细胞。还有甘油的毒性问题，冷冻保护剂越安全，对血库才能更有利。      Higgin说他的团队正在调查多种其他的微流体技术，希望能够解决上述问题。基于膜的设备处理是一个极好的开端因为此过程足够简单。http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/41521/title/Next-Generation--Precision-Blood-Rinsing/  阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120009.html

   阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120008.html

联科生物凋亡检测试剂盒（Annexin V/PI apoptosis kit，Cat#：AP101）是用FITC标记的重组人Annexin V来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸的一种细胞凋亡检测试剂盒。可以使用流式细胞仪，荧光显微镜或其他荧光检测设备进行检测。本试剂盒还提供了碘化丙啶（PI）染色液，PI可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，Annexin V-FITC可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同时期的细胞区分开来。试剂盒组分目录号/规格 组分               AP101-30 AP101-60 AP101-100 30T 60T 100T Annexin V-FITC 150ul 300ul 500ul 5x Binding Buffer 5ml 10ml 15ml Propidium Iodide(PI) 300ul 600ul 1000ul试剂盒步骤样品处理 (1)、用合适的方法诱导细胞凋亡；(2)、悬浮细胞离心（1500rpm 离心 5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化并用含血清培养基洗一次（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；或直接用Accutase酶消化（无需终止）；1500rpm 离心 5min收集细胞；(3)、用PBS洗涤细胞两次（1500rpm离心5min）收集1-5 X105细胞，弃上清；(4)、制备1X Binding Buffer缓冲液：按10次分析的量计算，加1ml  5X Binding Buffer缓冲液到4ml的去离子水；(5)、用500ul  1X Binding Buffer重悬细胞(第4步稀释的缓冲液）(6)、加入5ul annexin-V FITC和10ul PI(7)、避光室温孵育5分钟(8)、上机检测流式检测     流式分析Annexin-V FITC（放射波长=488nm；吸收波长=530nm）用FITC信号检测（通常是FL1通道）；PI染液用PE信号检测（通常是FL2通道） 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120007.html

 1、制备PBMC，并调整细胞浓度至107/ml。2、在每个流式上样管中加入100 μl准备好的细胞悬液，细胞数约为1x106个。3、按照细胞表面抗原染色方法标记CD4和CD25。根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量（一般来说是20ul，可能随批次有差异）。按个人要求设置空白管、对照管、补偿管和样本管。4 ℃孵育30 分钟。 4、用预冷PBS溶液洗涤细胞，300 -400 g离心5分钟，去上清。5、用3倍体积的固定/破膜稀释液 稀释 固定/破膜浓缩液，制成固定/破膜工作液，注意要新鲜配制，每个样本的用量为1ml。6、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3稀释好），并再次旋涡混匀。7、避光4℃孵育30分钟到60分钟。8、将破膜缓冲液用去离子水1:9稀释，制成工作液。每个样本的用量为4~5ml。9、无需洗涤，直接加入2ml 破膜缓冲液（Permeabilization Buffer）300 -400 g离心洗涤细胞并弃去上清液。10、（可选）重复第9步操作洗涤细胞。11、加入100 ul PBS重悬细胞。12、（封闭可选）体系中加入2%的大鼠血清2 ul，室温避光孵育30分钟。13、体系加入适量的Foxp3抗体，对照管中加入适量的同型对照，具体用量参照说明书，避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。14、加入2ml破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。15、重复上一步洗涤细胞。16、用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。                 注：以上说明书仅供参考，具体实验请对照厂商说明书操作。 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120006.html

 1、在每个流式上样管中加入100 μl准备好的细胞悬液，细胞数约为1x106个.2、按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。根据说明书加入CD4和CD25抗体100 μl体系中使用0.125 μg FITC anti-mouse CD4，0.06 μg APC anti-mouse CD25抗体。最好根据这些试剂详细的说明书操作。4 ℃孵育30 分钟。孵育表面抗体之前加入Fc受体阻断剂。 3、用预冷流式染色缓冲溶液洗涤细胞（离心并转移）。4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3稀释好），并再次旋涡混匀。5、避光4℃孵育30分钟到18小时（孵育30分钟到18小时，结果一样）。6、加入2ml 破膜缓冲液（Permeabilization Buffer）（1:9去离子水稀释）离心洗涤细胞并弃去上清液。7、重复第6步操作洗涤细胞。8、（可选）加入含0.5 μg Fc受体阻断剂的破膜缓冲液，保证100 μl体系4 ℃孵育15分钟。9、封闭液无需洗去，体系加入0.5 μg PE anti­mouse/rat Foxp3抗体和PE Rat lgG2a同型对照（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释），避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。10、加入2ml破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。11、重复上一步洗涤细胞。用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。 以上步骤仅供参考，以厂家说明书为准。 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120005.html

实验方法 该实验采用的是经过优化的喜树碱诱导Jurkat细胞系凋亡实验条件。其他类型的细胞需做相应调整。该试剂盒在传统及Attune?声波聚焦流式细胞仪上验证过，使用Attune?声波聚焦流式细胞仪时，各种流速（25 μL/min 到 1,000 μL/min）都可以。 1.用有效方法诱导凋亡；设一不加诱导的阴性对照。2.孵育之后收集细胞并用冷的PBS洗涤。3.制备1×annexin V 结合缓冲液：按10次分析的量计算，加1 mL试剂C到4ml的去离子水中。4.制备100μg/mL的PI工作液：用45μl 1×annexin V 结合缓冲液稀释5μl试剂B，剩余可保存备用。5.再次离心步骤2中收集的细胞，弃去上清，重悬在1×annexinV 结合缓冲液。计数并用上述缓冲液稀释至约1 × 106 cells/mL。按每次实验用量100μl准备充分。6.在每100μl细胞悬液中加入5μl试剂A和1μl步骤4制备的PI工作液。7. 室温孵育15min。8. 孵育结束，加400μl 1×annexin V 结合缓冲液，轻轻混匀后置于冰上。9.尽快对染色细胞进行分析。可用FL1检测530nm激发光，FL3检测>575nm的激发光。细胞群将被分为三组：活细胞显示弱荧光，凋亡细胞显示绿色荧光，而死细胞则同时发红、绿荧光。10. 可用荧光显微镜验证结果，适用检测FITC、TRITC或Texas Red®的滤光片检测。图1. Jurkat细胞经10μM喜树碱处理4h(B)或不处理(A)的流式图。细胞经喜树碱处理后，凋亡细胞增多。A=凋亡细胞；V=活细胞；N=坏死细胞。 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120004.html

需要试剂 Human Regulatory T Cell Whole Blood Staining Kit （#88-8996-40）包含组分：(1)、1X RBC Lysis Buffer: 200 mL (2)、Flow Cytometry Staining Buffer: 600 mL (3)、Fixation/Permeabilization Concentrate: 30 ml (4)、Fixation/Permeabilization Diluent: 100 mL (5)、Anti-Human Foxp3 PE (PCH101): 25 testsAnti-human CD4 （标记可选）Anti-human CD25（标记可选）Rat IgG2a K Isotype Control PE (#12-4321-41)推荐操作步骤 取100ul全血，加入适量Anti-human CD4和Anti-human CD25，4 ℃孵育30 分钟（根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量）。按个人要求设置空白管、补偿管、同型对照管和样本管。 染色完的全血不用洗，每管加入2-3ml 1X RBC Lysis Buffer，混匀。室温孵育10分钟。观察溶液透亮后，300 -400 g离心5分钟，去上清。加入2-3ml Flow Cytometry Staining Buffer，300 -400 g离心5分钟，去上清。重复洗一次。制备固定/破膜工作液：1份Fixation/Permeabilization Concentrate加入到3份Fixation/Permeabilization Diluent中，按样品量现用现配，每管用量为1ml。旋涡震荡细胞沉淀，每管加入1ml的固定/破膜工作液（第6步配置准备的），并再次旋涡混匀。避光4℃孵育30分钟到60分钟，在此时间内效果一致。加入2-3ml Flow Cytometry Staining Buffer，300 -400 g离心5分钟，去上清。重复洗一次。样本管中加入5ul或1test的Foxp3抗体，同型对照管中加入0.25ug Rat IgG2a K Isotype Control PE，保证最终染色体积不大于100ul，避光4℃孵育30-60分钟，根据结果优化染色时间。加入2ml Flow Cytometry Staining Buffer洗涤细胞并弃去上清液。用300-500ul Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。                 注：以上说明书仅供参考，具体实验请对照厂商说明书操作。 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120003.html

免疫荧光是标记免疫技术发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。除了这些基本步骤，以下建议可以帮助您获得更好的实验结果。细胞固定和通透   为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下，需要通过以下步骤得以实现：细胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。 抗体特异性   免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。 合适的抗体稀释比例   通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。 优化缓冲液和封闭剂   尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。Rockland可提供优化过的IHC用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验。 选择正确的二抗   如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。同时，请优先选择来自同一物种的二抗。 使用合适的细胞密度   选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好。 多重染色   对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致。 降低背景   高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替BSA做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，推荐洗涤液为PBS+0.05%Tween。 封片   作为免疫荧光的最后一步，可以提高折射率，保护样品。 数据分析   观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。 详情见：http://www.rockland-inc.com/IF-Microscopy-Tips.aspx?utm_source=tips&utm_medium=email&utm_campaign=marker  阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120002.html

   eBioscience公司提供了哪些抗体？ A：物种——人、小鼠、大鼠、非人灵长类、犬类等。检测指标——包括细胞表面标记（CD分子，膜骨架，趋化因子受体）和胞内指标（细胞因子，核内转录因子）。抗体标记——生物素标记抗体，亲和纯化抗体以及直标荧光素抗体。eB抗体的直标荧光素有（括号内是发射光波长）：紫光（405nm）激发： eFluor® 450 (450nm) 蓝光（488nm）激发：FITC (518nm)、Alexa Fluor® 488 (519nm)、PE (575nm)、PerCP-eFluor610(610nm)、PE-Cy5 (667nm)、PerCP-Cy5.5 (695nm)、PerCP-eFluor® 710 (710nm)、PE-Cy7 (785nm)黄绿光（532-561nm）激发：PE (575nm)、PE-Cy5 (667nm)、PE-Cy7 (785nm)红光（633nm）激发：APC (660nm) 、eFluor® 660 (660nm)、Alexa Fluor® 647 (668nm)、Alexa Fluor® 700 (723nm)、APC-eFluor® 780 (780nm) eBioscience抗体的保存期限？ A：请见试剂瓶包装上的标注，如没有标注的一般为收货后6个月。特殊情况见说明书或咨询联科生物。 eBioscience抗体交叉反应性 A：ebioscience公司测试了抗体与非人灵长类及猪、犬类的交叉反应性。 抗人抗体的交叉反应性请见网页http://www.ebioscience.com/resources/cross-reactivity/human-antibody-cross-reactivity-chart.htm 抗小鼠抗体的交叉反应性http://www.ebioscience.com/ebioscience/appls/monkey2.htm 亲和纯化抗体与功能性抗体的区别？A：eBioscience提供的亲和纯化抗体含有叠氮化钠，这些产品主要用于flow cytometry, WB, IP, and IHC 实验；功能级抗体则不含有叠氮化钠，而且进行了内毒素检测，这些抗体的内毒素含量低于或者等于工业内毒素标准0.001 ng/ mg。功能性抗体一般用于体外功能实验，如刺激、阻断、中和。  eBioscience公司提供抗体浓度是多大？ A：eBioscience公司的提供抗体包括两种规格：ug和test包装.  在ug规格的抗体中，亲和纯化、生物素标记、功能纯化生物素标以及FITC和Alexa Fluor® 488标记的抗体浓度一般为0.5 mg/ml；APC、PE、Alexa Fluor® 647,700和tandem标记的抗体浓度一般为0.2 mg/ml；功能纯化抗体浓度一般为1 mg/ml；具体以抗体标识为准。 tests规格的抗体浓度标注在说明上，通常建议每test为5 ul。 eBioscience抗体可以应用于哪些实验 A: 具体单个抗体的应用请见说明书 Flow cytometric analysis- surface antigen staining (FC) 细胞表面抗原的流式检测 Flow cytometric analysis- intracellular staining (IC Flow) 细胞内抗原的流式检测 Immunohistochemistry (IHC) 免疫组织化学 Immunohistochemistry- frozen sections (IH/F) 免疫组织化学——冰冻切片 Immunohistochemistry- paraffin sections (IHC-Paraffin) 免疫组织化学——石蜡切片 Immunoblotting (WB) 免疫印记 Immunoprecipitation (IP) 免疫沉淀 ELISA 酶联免疫吸附分析 ELISPOT 酶联免疫斑点 Bioassays (FA) 生物分析（功能实验） Neutralization/Blocking studies (NU) 中和/阻断研究 In vitro Cytokine Capture Assay (IVCCA) 体外细胞因子捕获分析 In vivo studies in mice 小鼠的体内研究 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 染色质免疫沉淀    阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120001.html

   一定要在Lysis Buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂；加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间，因为磷酸化的蛋白只占总蛋白量的极少部分；选择优质的磷酸化抗体，所以要选好的厂商，Novus为全球高端抗体品牌，其磷酸化抗体效果不错；抗体的稀释倍数要优化，可以根据厂商建议进行优化；用含5% BSA的TBST稀释抗体，不要用常见的5% -Fat Milk的TBST；磷酸化蛋白WB时背景也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则背景太深盖住想要的那条条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅.；磷酸化蛋白WB时,用TBST洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快,洗的时间不要太长,孵育一抗和二抗之后分别洗5min 3次即可,宁愿背景深一些,总比做不出来强得多.另外，洗的时候，最好不要把几张膜叠在一起洗。 阅读原文：http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014110030.html

氧化还原信号通路和硫醇修饰介绍（1-3页）  生命是由连续的化学反应来维持的，这过程包含了许多活性生物分子，其中活性氧（ROS）具有极特殊的作用。值得注意的是，ROS是正常的细胞功能产物，同时对异常刺激做出反应。过高和不平衡的ROS水平经常会导致氧化应激反应，这是由于高水平的ROS可以损坏生物大分子（如脂质，蛋白质，DNA等）的所有亚型并最终引起细胞死亡（如下图）     氧化还原信号通路正在急速发展，部分因为它在基础生理和人体健康每个时期的重要性。掌握复杂的活性氧，氮和硫信号通路需要创新的科技方法。这期Cayman目录展现出了许多此热门领域的研究工具。硫醇修饰检测（4-5页）  二硫键水解 S-Sulfhydration Protein Detection Kit 亚磺酰化 Sulfenylated Protein Cell-Based Detection Kit 亚硝基化 S-Nitrosylated Protein Detection Kit 谷胱甘肽化 S-Glutathionylated Protein Detection Kit新产品亮点（6页） 胞内突发性呼吸O2消耗成像试剂盒 Intracellular O2 Respiratory Burst Imaging Kit氧化还原生物学（7-10页） 氧化还原活性检测试剂盒  氧化还原抗体  氧化还原酶  氧化应激生物标记检测试剂盒  硝基酪氨酸抗体 抗氧化检测/活性试剂盒 Redox Signaling Currents 2014 - Multisciences.pdf PDF下载（高清） 阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014110029.html

为什么用BioVision’s Human CellExp? proteins? 这些蛋白包含了所有的翻译后修饰形式如二硫键，糖基化和磷酸化等按照亚单位组装，折叠，分泌和其他过程模拟天然蛋白表现出相同的化学和生物特性，如稳定性，等电点，可溶性，亲和力和生物活性无血清培养基生产，因此批次间差异极小，避免病菌污染。图：通过用不同剂量Human CellExp? 人重组IL-1β刺激小鼠D10S细胞增殖，检测该蛋白生物活性 Human CellExp? 人重组IL-1β的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE  阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014110028.html

血管生成分析 --- Angiogenesis (Tube Formation) Assay 目录号：K905-50  细胞迁移分析 --- EZCellTM Cell Migration/Chemotaxis Assay Kit 目录号：K906-100内皮细胞迁移对新血管生成十分重要。这些过程不仅在正常发育中有重要作用，对肿瘤生长和入侵中同样重要。Biovision的试剂盒可以帮助你研究血管生成(K905)和定量分析对不同生化刺激做出的细胞迁移作用(K906)主要特点：  - 管腔形成形象化  - 血管生成的放映  - 半定量   - 数据庞大，操作简单  主要特点：  - 测量细胞应激下的细胞迁移  - 显现影响细胞迁移的化合物  - 定量，高灵敏度分析  -适合高通量 内皮细胞在细胞外基质胶上的管腔形成 HT-1080细胞在迁移诱导物刺激下的细胞迁移及标准曲线 阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014110027.html

蛋白尿作为一个病态特征，是由于尿液中高浓度白蛋白的存在。它已经成为一个有用的标记，可对患有糖尿病、高血压和心血管疾病慢性肾脏疾病的病人进行早期检查。Biovision的白蛋白（尿蛋白）荧光检测试剂盒（K550-100）利用了可特异性识别不同哺乳种类生物样本白蛋白的AB580探针。主要特征：快速：与耗时的ELISA相比，45分钟可测定高灵敏度：检测到低至20 mg / L的白蛋白高特异性：不识别其他蛋白或代谢产物如IgG，尿素等经过验证的：用人类尿液和唾液样本荧光定量 （Ex/Em = 600/630 nm）(a) 健康人和糖尿病人尿液中(40 μl each)和健康人唾液 (30 μl)中的白蛋白检测. (b) 人尿中选择的部分代谢物和蛋白的相对荧光值. 分析并比较人血清白蛋白human serum albumin (30 μg)和抗坏血酸ascorbic acid (20 mM), 葡萄糖glucose (20 mM), 肌酸酐creatinine (20 mM), 尿素urea (20 mM),溶菌酶 lysozyme (30 μg),胰蛋白酶 trypsin (30 μg)及IgG (30 μg)的相对荧光值。 阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014110026.html