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| 1、制备PBMC,并调整细胞浓度至107/ml。 2、在每个流式上样管中加入100 μl准备好的细胞悬液,细胞数约为1x106个。 3、按照细胞表面抗原染色方法标记CD4和CD25。根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量(一般来说是20ul,可能随批次有差异)。按个人要求设置空白管、对照管、补偿管和样本管。4 ℃孵育30 分钟。 4、用预冷PBS溶液洗涤细胞,300 -400 g离心5分钟,去上清。 5、用3倍体积的固定/破膜稀释液 稀释 固定/破膜浓缩液,制成固定/破膜工作液,注意要新鲜配制,每个样本的用量为1ml。 6、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)(1:3稀释好),并再次旋涡混匀。 7、避光4℃孵育30分钟到60分钟。 8、将破膜缓冲液用去离子水1:9稀释,制成工作液。每个样本的用量为4~5ml。 9、无需洗涤,直接加入2ml 破膜缓冲液(Permeabilization Buffer)300 -400 g离心洗涤细胞并弃去上清液。 10、(可选)重复第9步操作洗涤细胞。 11、加入100 ul PBS重悬细胞。 12、(封闭可选)体系中加入2%的大鼠血清2 ul,室温避光孵育30分钟。 13、体系加入适量的Foxp3抗体,对照管中加入适量的同型对照,具体用量参照说明书,避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。 14、加入2ml破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。 15、重复上一步洗涤细胞。 16、用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞,并上机检测并分析。注:由于染色过程中使用了细胞固定和破膜,对比起活细胞在形态上会有一定变化,因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。 注:以上说明书仅供参考,具体实验请对照厂商说明书操作。 |
阅读原文:http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120006.html
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