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2、按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。根据说明书加入CD4和CD25抗体100 μl体系中使用0.125 μg FITC anti-mouse CD4,0.06 μg APC anti-mouse CD25抗体。最好根据这些试剂详细的说明书操作。4 ℃孵育30 分钟。孵育表面抗体之前加入Fc受体阻断剂。 3、用预冷流式染色缓冲溶液洗涤细胞(离心并转移)。 4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)(1:3稀释好),并再次旋涡混匀。 5、避光4℃孵育30分钟到18小时(孵育30分钟到18小时,结果一样)。 6、加入2ml 破膜缓冲液(Permeabilization Buffer)(1:9去离子水稀释)离心洗涤细胞并弃去上清液。 7、重复第6步操作洗涤细胞。 8、(可选)加入含0.5 μg Fc受体阻断剂的破膜缓冲液,保证100 μl体系4 ℃孵育15分钟。 9、封闭液无需洗去,体系加入0.5 μg PE antimouse/rat Foxp3抗体和PE Rat lgG2a同型对照(用Permeabilization Buffer工作液进行稀释),避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。 10、加入2ml破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。 11、重复上一步洗涤细胞。 用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞,并上机检测并分析。注:由于染色过程中使用了细胞固定和破膜,对比起活细胞在形态上会有一定变化,因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。 |
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以上步骤仅供参考,以厂家说明书为准。 |
阅读原文:http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120005.html
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