PI使用方法

1.1 实验材料

1. 荧光显微镜

2. 2X SSC

3. 无DNA酶的RNA酶

4. 抗淬灭剂，如SlowFade® Gold (S36936) 或ProLong® Gold (P36930)抗淬灭剂

1.2 样品制备

使用适合您样品的固定步骤。其他染色后，进行PI染色。需要注意的是PI复染需要细胞膜通透。

1.3 RNA酶处理

若样品经多聚甲醛，甲醛或戊二醛固定，需要经RNA酶处理；若样品经甲醇乙酸或丙酮处理，即不需要RNA酶处理。

1.3.1样品使用2X SSC（0.3 M NaCl，0.03 M 柠檬酸钠，pH 7.0）短暂平衡。

1.3.2样品在含100μg/ml 无DNA酶的RNA酶的 2X SSC 中孵育 20min， 37℃。

1.3.3使用2X SSC润洗样品三次，每次1min。

1.4 复染

1.4.1 使用2X SSC 平衡样品。

1.4.2 使用2X SSC 将1mg/ml（1.5M）PI储液 1:3000 稀释为500nM，通常约300μl足够一个盖玻片染色。
使用稀释后的染液覆盖细胞，孵育1-5min。

1.4.3 使用2X SSC润洗样品几次。小心吸干玻片上多余的缓冲液，加入适量的抗淬灭剂如Molecular Probes SlowFade® Gold antifade reagent (S36936) 或 ProLong® Gold antifade reagent (P36930)。

1.4.4 使用荧光显微镜观察样品。

2、复染悬浮细胞用于流式细胞仪

2.1 实验材料

1. 流式细胞仪

2. PBS

3. 乙醇

4. Tris 染色缓冲液（见步骤2.3.1）

2.2样本制备

使用适合于样品的固定方法，或者使用如下步骤。

2.2.1 收集2 × 10^5-1 × 10^6个细胞，离心，弃去上清，轻弹管底以用残余液体重悬细胞，加入1ml PBS（室温）。

2.2.2 将细胞悬液缓慢转移至4ml高速震荡的无水乙醇（-20℃）中，孵育5-15min（-20℃）。

2.2.3 离心，弃去乙醇，轻弹管子，加入5ml PBS（室温），使细胞水合15min。

2.3复染

2.3.1 使用染色缓冲液（100 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.1% Nonidet P-40）
1:500稀释1 mg/mL (1.5 mM)的PI储液为3 μM溶液，每个样品需1ml。

2.3.2 步骤2.2.3的样品离心，弃去上清，轻弹管底，加入1ml PI溶液，室温，孵育15min，然后在流式细胞仪上分析（在染液存在情况下）。如果要使用荧光显微镜观察，需离心，弃去上清，使用新鲜的缓冲液重悬细胞。取一滴细胞悬液于玻片，盖上盖玻片，使用合适的滤光片观察。

3、复染样品用于染色体荧光原位杂交技术（以下称染色体FISH）

3.1 实验材料

1. 荧光显微镜

2. dH2O

3. PBS

4. RNA酶

5. 抗淬灭剂（可选）

3.2 样品制备

根据标准步骤制备样品（见参考文献3,4）。在复染之前，使用去离子水暂短润洗样品，去除残余的盐缓冲液。空气干燥。最后的润洗对于降低非特异性结合有很大帮助。

3.3 复染

3.3.1 使用PBS 1:1000稀释1 mg/mL (1.5 mM)的PI储液为1.5μM的染色溶液。吸取300μL的染色溶液直接加入样品。如果必要，加入终浓度为10μg/ml的Rnase A（新鲜配制）。使用塑料盖玻片使染液均匀分布。

3.3.2 室温，避光孵育30min，或者37℃避光孵育（如加入RNase）。

3.3.3 去除盖玻片，使用PBS或去离子水润洗，洗去未结合的染料。

3.3.4 用吸水纸小心洗去样品周围残余的液体。盖上玻璃盖玻片，石蜡封片。另外，也可以根据操作手册，加入适量的抗淬灭剂。

3.3.5 使用荧光显微镜观察细胞。

    参考文献

1. J Mol Biol 13, 269 (1965);  

2. Methods Cell Biol 30, 417 (1989);  

3. Methods Enzymol 168, 741 (1989);  

4. Pardue, M.L. in Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, B.D.
 Hames and S.J. Higgins, Eds., IRL Press, Oxford, England (1985).