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1、Western用的一抗,单抗好些还是多抗好些? |
做Western来讲,理论上单抗比多抗的特异性要好,但单抗种类较少,一般价格偏高,所以一般来说多抗足够了。用于Western的抗体和用于ELISA的抗体,一般来说用于Western的抗体识别的是氨基酸序列特异性,而可用于ELISA的抗体要看抗原种类,有些是识别氨基酸序列特异性,有些是识别构象特异性,所以一般根据说明书来确定。做免疫印迹选择抗体主要考虑两个问题,一时所选抗体是否识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白,另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。 |
2、半干转是否要去膜、滤纸、胶同样大小,因为胶大小不一定规则,膜和滤纸会大一点,那样会不会短路? |
可以相等,但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了,上下两层滤纸也不能因过大而相互接触,这样会短路,电流不会通过胶和滤纸。转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干转是慢慢变高的,最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。 |
3、Western Blot哪种染色好? |
胶体金,灵敏度高,检测范围可达到pg级,但染色稳定。 生物素话灵敏度位于1.2之间,可用于任何一种膜。 |
4、不能很好的将大分子量蛋白转移到膜上,转移效率低怎么解决? |
可以考虑,转移缓冲液中加入20%甲醇,因为甲醇可以降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液中加入终浓度0.1% SDS,也是为了增加转移效率;用优质的转移膜,或使用小孔径的NC膜,低浓度胶,提高转移电压/电流,增加转移时间。 |
5、DAB显色,碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么。 |
DAB显色在辣根过氧化物酶的作用能形成一种灰褐色的终末产物,该产物难溶于醇和其他有机溶剂,DAB的氧化还能引起聚合作用,导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。 |
阅读原文:http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120014.html
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