人全血Foxp3实验步骤

需要试剂

1. Human Regulatory T Cell Whole Blood Staining Kit （#88-8996-40）

包含组分：

(1)、1X RBC Lysis Buffer: 200 mL
(2)、Flow Cytometry Staining Buffer: 600 mL
(3)、Fixation/Permeabilization Concentrate: 30 ml
(4)、Fixation/Permeabilization Diluent: 100 mL
(5)、Anti-Human Foxp3 PE (PCH101): 25 tests

• Anti-human CD4 （标记可选）

• Anti-human CD25（标记可选）

• Rat IgG2a K Isotype Control PE (#12-4321-41)

推荐操作步骤

1. 取100ul全血，加入适量Anti-human CD4和Anti-human CD25，4 ℃孵育30 分钟（根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量）。按个人要求设置空白管、补偿管、同型对照管和样本管。 

2. 染色完的全血不用洗，每管加入2-3ml 1X RBC Lysis Buffer，混匀。室温孵育10分钟。

3. 观察溶液透亮后，300 -400 g离心5分钟，去上清。

4. 加入2-3ml Flow Cytometry Staining Buffer，300 -400 g离心5分钟，去上清。

5. 重复洗一次。

6. 制备固定/破膜工作液：1份Fixation/Permeabilization Concentrate加入到3份Fixation/Permeabilization Diluent中，按样品量现用现配，每管用量为1ml。

7. 旋涡震荡细胞沉淀，每管加入1ml的固定/破膜工作液（第6步配置准备的），并再次旋涡混匀。

8. 避光4℃孵育30分钟到60分钟，在此时间内效果一致。

9. 加入2-3ml Flow Cytometry Staining Buffer，300 -400 g离心5分钟，去上清。

10. 重复洗一次。

11. 样本管中加入5ul或1test的Foxp3抗体，同型对照管中加入0.25ug Rat IgG2a K Isotype Control PE，保证最终染色体积不大于100ul，避光4℃孵育30-60分钟，根据结果优化染色时间。

12. 加入2ml Flow Cytometry Staining Buffer洗涤细胞并弃去上清液。

13. 用300-500ul Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。                 

注：以上说明书仅供参考，具体实验请对照厂商说明书操作。