光保护蛋白

糖尿病，尤其是2型糖尿病，已然成为21世纪人类面临的最大的健康挑战之一。2型糖尿病往往是由不健康的生活方式以及摄入大量高能量密度食物所导致，因此世界各国科学家提出了多种糖尿病干预策略，重点集中在改变生活方式和饮食结构。例如，强调植物性食物并减少动物性食物的地中海饮食已广泛用于2型糖尿病的管理。最近一项探索三种常量营养素比例（即蛋白质、脂肪和碳水化合物）对小鼠健康影响的研究发现，减少蛋白质摄入对于改善代谢健康和寿命至关重要。多个研究也发现减少蛋白质摄入是延长寿命和改善代谢健康的一个重要因素，另有一些研究也发现限制某些关键的氨基酸如蛋氨酸或亮氨酸也可以改善葡萄糖稳态。除了蛋白质或氨基酸限制的饮食策略，禁食或热量限制长期以来被认为是一种延长寿命和改善代谢健康的有效手段。近年来，许多热量限制的方式如间歇性节食和时间限制性饮食已被广泛用于改善包括糖尿病在内的代谢性疾病。有研究表明，间歇性节食可以有效控制1型和2型糖尿病小鼠的血糖稳态，也有研究揭示了间歇性节食控制血糖稳态是通过促进糖尿病小鼠胰岛β细胞的再生所介导。近日，中国科学院上海营养与健康研究所陈雁研究组在 Science Bulletin 期刊在线发表了标题为：Intermittent protein restriction protects islet beta cells and improves glucose homeostasis in diabetic mice 的研究论文。该研究发现，间歇性蛋白限制可以保护糖尿病小鼠的胰岛β细胞并改善血糖稳态。虽然持续的蛋白质或者氨基酸限制以及间歇性节食已被证明可以改善糖尿病，但目前还没有研究探讨间歇性的蛋白限制是否足以干预糖尿病。该项研究探讨了一种间歇性蛋白限制（IPR）的饮食方式，发现IPR可以迅速缓解STZ诱导的1型糖尿病小鼠以及瘦素受体缺陷导致的2型糖尿病小鼠的高血糖血症。针对小鼠胰岛的进一步研究发现IPR可以增加胰岛β细胞数量、促进β细胞增殖、并改善β细胞功能。在外周组织中，IPR可以减少肝脏的糖异生并提高骨骼肌的胰岛素敏感性。与持续性低蛋白饮食相比，IPR对于糖尿病小鼠的肝脏脂肪积累和损伤更轻。此外，通过小鼠胰岛单细胞测序分析发现了IPR可以逆转糖尿病导致的胰岛β细胞数量的减少以及胰岛免疫细胞的浸润。由于IPR这一饮食方式能够有效控制血糖并保护胰岛β细胞，比禁食或热量限制可能更容易被人接受，并避免了持续性蛋白限制的不良作用，故IPR在未来有较大的应用转化潜力。间歇性蛋白限制保护糖尿病小鼠胰岛β细胞并且改善糖稳态中国科学院上海营养与健康研究所陈雁研究员为该论文的通讯作者，博士研究生韦思颖、李晨晨为该论文共同第一作者。该项工作得到了科技部、国家自然科学基金委员会等经费的资助，同时也得到了中国科学院上海营养与健康研究所公共技术平台和动物平台的支持。论文链接：https://doi.org/10.1016/j.scib.2021.12.024

9月8日-9日，“第十三届中国秋季粮油市场分析暨贸易洽谈会”在黑龙江省哈尔滨市友谊宫成功举办。2016年国内外大豆及油粕市场经历了熊牛行情的转换，在下一个年度牛市行情能否持续，已经成为大豆及油粕市场高度关注的热点。进口大豆面临更加复杂的国际市场供需及经济环境，国产大豆种植面积及产量大幅增加，市场行情及购销格局将产生新的变化。会议邀请了20位专家做大豆及粮油相关报告，近千名来自全国各地的实体企业代表参会，共同分析和判断黑龙江省、东北三省乃至全国范围在未来的几年内大豆、玉米市场的发展动态，并通过洽谈会来帮助参会的企业了解市场，更好地把握住市场带来的商机。“第十三届中国秋季粮油市场分析暨贸易洽谈会”现场　　聚光科技（杭州）股份有限公司（以下简称”聚光科技”）作为协作单位受邀参与了此次盛会，为了能够给东北的粮农及收购企业提供有力的分析依据，及时掌握大豆的真实质量数据，聚光科技携带最新推出的高科技便携式蛋白仪参与了此次会议，帮助大批的参会单位现场做质量判断，等级判别。快速而精准的现场数据输出，得到了众多参会企业的强烈好评。通过这台便携式蛋白仪检测的蛋白数据，会议现场就促成了5家大豆收购企业及供销企业的采购意向，作为仪器的生产商感到非常欣慰。让人更加振奋的是，聚光科技在参会当天就完成了20家客户的蛋白仪设备采购订单，这是所有近红外分析仪参会史上的第一次，说明该仪器着实满足了广大用户的迫切需求，预计不远的将来会出现爆发性的市场增长。聚光科技便携式蛋白仪展台前的火爆场面　　同时由于参会期间便携式蛋白仪的优异表现，聚光科技在现场收到了大批客户的邀请，希望能够携带设备去客户工厂进行试用，并且与现有的三款主流进口设备进行比对测试，比对结果出乎了大部分人的意料，设备的稳定性完全达到进口的水准，甚至超出了部分进口设备，再次证明了“中国制造”一样可以造出好产品。　　此次聚光科技携带的便携式蛋白仪型号为EXPEC1230系列近红外分析仪，采用目前国内主流的全息数字光栅和高灵敏度铟镓砷检测器（TEC制冷恒温）相结合的光学设计，波长范围1000-1800nm，可通过收集、电脑操作，实现固体颗粒、条状、粉末及液体样品中一些物理和化学成分的无损快速检测，整套系统操作简单，满足实验室精确测量及室外便携式应用的不同需求。

本篇继上一篇“实用建议：“如何合理设计稳定的冻干蛋白配方（一）”继续为大家分享蛋白样品冻干的理想赋形剂有哪些、基于成功蛋白冻干配方会导致Final失败的一些细节问题等。 》》》对于蛋白样品，理想的赋形剂有哪些？从冻干对蛋白的所有危险以及我们需要在各个环节考虑的所有因素来看，快速开发一个稳定的蛋白配方看起来似乎是不可能的。幸运的是，如果我们能够采用合理的方法对配方进行很好的设计，大多数的配方问题是可以得到快速解决。这里，我们主要是对初始配方成分的选择提供基础。在一些情况下，初始的配方很有可能就是走向市场的Final产品。给定的组分，进行不同微小的修改，已经被成功地用于蛋白药物。需要强调的是对于冻干配方，在能够提供良好稳定性和结构的情况下，成分越简单越好。所加入的赋形剂都须要有数据证明对配方起有益的作用。01给定蛋白质维持稳定性的具体条件对于一些通用型的稳定剂，可以有效地保护绝大多数的蛋白质，在选择这些稳定剂之前，我们有必要通过优化影响蛋白物理和化学稳定性的具体因素来选择合适的稳定剂。影响蛋白物理和化学稳定性的具体因素：1. 避免极端的pH值可以显著降低蛋白脱氨基的几率。而且，通过优化溶液的pH值，可以显著提高蛋白在冻干过程中抵抗去折叠的能力。2. 还应该研究其他能提高蛋白质稳定性的特异性配体（通过增加去折叠的自由能）。肝素和其他聚阴离子对生长因子的稳定性影响就是一个很好的例子。3. 其它需要考虑的重要因素是离子强度对蛋白的去折叠和聚合的影响。须意识到，在预冻过程中，由于冰的形成将溶液浓缩，离子强度可增加50倍。因此负责原料药纯化和做药物配方前研究的人员已经对这些问题有了深刻的认识，配方科学家应该在着手设计冻干配方之前与他们进行沟通。即使在针对蛋白质稳定性优化的特定的溶液条件下，但是如果样品需要幸免于冻干的损害并长期保存，有必要加入一些其它的保护剂。首先，我们考虑一些已经用在冻干蛋白配方中的成分，但它们不能提供蛋白的稳定性，而且可能会促进蛋白在储存期间的破坏。我们将提供一个简单、有效的思路，并且讨论选择这些成分的原理。02不能提供蛋白稳定性的赋形剂部分多聚物作为赋形剂的优缺点在冻干工艺的快速开发过程中，为了获得一个强壮的蛋糕结构，一些多聚物，如葡聚糖，羟乙基淀粉，因具有较高的塌陷温度，导致Final产品的Tg也会比较高，常常是受欢迎的赋形剂。不好的是，这些多聚物在冻干过程中不能抑制蛋白结构的去折叠，因此在后续的储存中不能提供稳定性。无法抑制冻干诱导变性的原因大概是聚合物过大而无法与蛋白质氢键合，无法代替脱水过程中损失的水，或者是因为聚合物与蛋白质形成了分离的无定形相。尽管当这些多聚物单独使用时不是一种很好的稳定剂，但是经证实，如果其结合双糖稳定剂可以具有较好好的作用。冻干过程中的有效稳定剂对大量的化合物进行测定，显示在冻干过程在较有效的稳定剂是双糖，但是避免使用还原性糖。还原性糖在冻干过程中可以有效抑制蛋白结构的去折叠，但是在干燥样品的储存过程中，可以通过美拉德反应（糖的羰基和蛋白质上的游离氨基）降解蛋白，结果形成含有降解蛋白的棕色糖浆，而不是含活性蛋白的白色蛋糕状结构。通常，我们减缓这个过程的方法是将样品储存在零度以下，这就失去了产品冻干的意义，这些还原性的糖包括：葡萄糖，乳糖，麦芽糖，麦芽糊精等。在早期的研究中，晶体类的填充剂如甘露醇，甘氨酸在冻干过程中不能提供蛋白很好的稳定性，但是，一些配方使用了这两种物质的混合物，并且成功地推向了市场。在这些案例中，甘露醇和甘氨酸适当的比例可以导致一大部分的化合物保持无定形状态。这部分无定形状态的化合物足以抑制冻干过程中蛋白的去折叠并且提供长期储存的稳定性。但是建议谨慎选择这种方法，因为达到合适的工艺条件再加上合适的赋形剂比例，既耗时又很难办到的。03赋形剂的合理选择如何合理的选择赋形剂？案例分享举个具体的案例说明，假设：1. 蛋白药物的浓度定在2mg/ml；2. 主要的降解途径是冻干后或复水后蛋白的聚合以及储存期间蛋白的脱氨基；3. 优化具体的条件（如用柠檬酸盐缓冲液控制pH为6）只能将冻干和复水后聚合程度降到10%，尽管样品在低于Tg温度的20℃下进行储存脱氨基速度仍然不能接受。加入晶体类的膨胀剂，如甘露醇，保持样品强壮的结构及良好的外观。在这种情况下，主要缺少的成分是非还原性双糖，其在干燥样品中会与蛋白形成无定形的结构，作为主要的稳定剂，主要选择蔗糖或海藻糖。它们在预冻阶段能够很有效地保护蛋白并且能够很好的抑制复水过程中蛋白结构的去折叠。预冻阶段的保护取决于初始糖的总浓度，有时，超过5%（w/t）的浓度可以尽可能大程度地保持蛋白的稳定性。相反，在干燥阶段，蛋白的保护取决于Final糖和蛋白的质量比。一般来说，糖和蛋白的重量比至少为1:1时，可以提供较好的稳定性，当达到5:1时，可以达到很佳的稳定性。保持蛋白的浓度不变，选取一定范围的糖浓度进行筛选和检测，通过干燥样品中天然结构保留率以及复水后蛋白聚合降低的程度来确定最合适的浓度。一般来说，合适的糖浓度，可以在冻干过程中提供蛋白很好的稳定性，并且如果Final样品的Tg高于储存温度，在后期的储存期间也可以提供蛋白较好的稳定性。例如，假定最高的储存温度为30℃，那么Final产品的Tg ＞50℃应该是稳定的，但前提是Final样品的含水量需要达到允许的水平，因为水分的存在会降低样品的Tg。可以使用DSC检测每种样品的Tg值。蔗糖/海藻糖如何选择？蔗糖和海藻糖，作为两种常用的稳定剂，均有其优势和劣势，可根据不同的情况进行选择：● 在任何水分含量的样品中，海藻糖均会有较高的Tg，因此较为容易冻干。另外Tg ＞50℃的条件可以允许样品有较高的残留水分。然而，技术工程师应该能够针对这两种双糖设计经济有效的工艺。如果样品中蛋白浓度较高，可以提高Tg，这样就会弱化海藻糖的作用；● 与蔗糖相比，海藻糖更能抵抗酸解，双糖水解后会产生还原性的单糖，这是需要避免的。通常情况下，如果pH不是很低，如pH4左右或更低，这个应该不是很大的问题；● 蔗糖在冻干过程中抑制蛋白去折叠方面看似比海藻糖更有优势，当蛋白在预冻阶段非常不稳定（需要较高的糖浓度）和/或蛋白浓度较高时，这种优势更明显。海藻糖的相对不稳定性是由于在预冻和干燥过程中其更易于与蛋白之间产生相分离。对于给定的配方，这是否会有问题不能被预测，因此，每种制剂配方都需要检查其保护蛋白的能力。表面活性剂的作用在这里，我们案例中的配方可能就比较完整了，就像许多蛋白质的情况一样。然而，我们假设，即使蔗糖完全抑制可检测的蛋白质去折叠，正如用红外光谱对干燥固体的结构分析所评估那样，在复水后，仍然有1%的聚合蛋白。因为在原始的样品中是没有任何聚合的，假设在冻干过程中，一小部分蛋白发生了去折叠，在复水后，部分这些分子又重新折叠，但是部分聚合在一起。这个实际上看起来是个很普遍的问题，就像在冻干之前一些处理造成的聚合。幸运的是，通过在配方中加入一些非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯（吐温）通常可以抑制蛋白的聚合。要求的浓度通常比较低（＜0.5% w/v），通过将表面活性剂滴定到包含所有其它组分的冻干制剂中，可以识别出理想浓度。应避免加入过量，因为表面活性剂在室温下是液体的状态，如果浓度较高，会降低配方的玻璃态转变温度。然而，通常在优化蛋白质稳定性所需的非常低的浓度下，不会有问题。表面活性剂看作是画龙点睛，通常在冻干产品配方中加入表面活性剂是有利的，可以抑制处理过程中界面引起的去折叠和聚集（如起泡夹带或瓶-液界面引起的）。最重要的是表面活性剂在冻干/复水过程中抑制聚合的能力，目前还不太清楚表面活性剂的保护在哪一步起作用的。有资料证明，表面活性剂在冻融及复水过程中可减少蛋白聚合并且在预冻阶段有助于抑制蛋白的去折叠，对干燥固体中聚集物特定红外波段的检查表明，表面活性剂可以抑制冻干过程中产生的聚集。在复水过程中，曲折叠分子的聚合能通过表面活性剂得到抑制，猜测是通过分子之间的相互作用和/或作为一种润湿剂，加速冻干产品的溶解。如果显示表面活性剂在复水过程中是有益的，则可以通过在稀释剂中加入表面活性剂来达到这种效果。 》》》还有哪些意想不到的危险可能会导致失败？尽管根据上述给出的建议，对于给定蛋白，我们可以设计出成功的配方，但是，还有其他一些问题可能会导致Final失败，特别是在长期储存期间。● 赋形剂中经常会有一些污染物，这些会导致蛋白快速的化学降解，糖类和甘露醇中会含有过渡金属元素，表面活性剂可能被过氧化物污染，所有的这些可以促进蛋白的氧化；● 在储存过程中，水分从胶塞转移到产品，引起水分参与的降解，直接损坏蛋白，并且降低蛋白的Tg,加速蛋白的降解，特别是当储存温度高于Tg 时；● 即使在高温（如40℃）下的储存稳定性研究中，一切都表现出理想的状态，但有一个常见的，但很少报道的事件可能是灾难性的，这个问题可以用下面的故事来说明。产品在实验室中在40℃下储存可以保持几个月的稳定性，在冬季，产品在运输过程中也保持良好的稳定性，没有来自消费者的问题报告，然而，有时在夏季，运输后，在室温下储存仅2周后发现产品过度降解，用差示扫描量热仪DSC对一开始的干燥粉末进行了检查，给出了合理的解释，结果发现，制剂中的甘露醇没有全部结晶，而是形成了Tg约为45℃的亚稳玻璃态，当在夏季运输过程中，超过了这个温度时，甘露醇变发生结晶，最先与甘露醇结合的水被转移到了剩余的无定形相中，蛋白相的水含量增加，降低了它的玻璃化转变温度，因此，加速了蛋白质的降解。这个问题可以使用DSC设计合理的退火方案使甘露醇再预冻阶段全部结晶来避免，另外也可以通过调整甘露醇的浓度，降低残留水分含量，使甘露醇即使在45℃的条件下也不会结晶。 》》》对于给定的蛋白药物，这些信息足够吗？对于大多数的蛋白，上面给出的建议一般会设计出成功的配方，但是，每种蛋白都有其独特的物理化学特性和稳定性要求。因此，针对每种不同的蛋白，配方也需要自定义设计。结合蛋白本身的特性知识以及选择合理的赋形剂可以快速设计出稳定的冻干蛋白配方。最后，在快速冻干工艺中保持干物质的物理性质和在干燥后获得天然的蛋白质之间需要折衷，研究表明：当蔗糖结合葡聚糖一起使用时，由于蔗糖的作用，蛋白质的天然结构可以保留在干燥的固体中；葡聚糖的存在提高了制剂的Tg，并提供了一种无定形的填充剂，快速干燥的同时保留了所需的蛋糕性质；其他的一些聚合物有可能提供与葡聚糖相同的优势，如羟乙基淀粉也具有较高的Tg，通常比葡聚糖更容易接受用于肠胃外给药。期望可以合理地利用这些多聚物作为Tg的调节剂，使得制剂更稳定，更容易快速冻干。莱奥德创冻干技术分享关注“莱奥德创冻干工场“，立即获取冻干线上技术分享内容。基于对于冻干研发的一些考量，莱奥德创创建了金字塔冻干技术分享平台：包含了从冻干理论基础，到配方和工艺开发，再到放大及生产，以及进阶的设备管理和线上线下专题内容分享。内容结合了来自Biopharma的冻干理论指导体系、来自于莱奥德创产品经理及应用工程师的实践经验总结及国内外专家的专题内容。获取方式Step 1：关注公众号 扫码关注莱奥德创公众号Step 2：点击菜单栏“冻干讲堂” Step 3：点击你感兴趣的内容Banner Step 4：开始学习 如果您对上述设备或冻干服务感兴趣，欢迎随时联系德祥科技/莱奥德创，可拨打热线400-006-9696或点击下方链接咨询。译自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》 John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997* 如有理解错误之处，还请参考原文关于莱奥德创冻干工场上海莱奥德创生物科技有限公司专注于提供前沿的冻干设备应用和制剂开发相关服务，依托于合作伙伴加拿大ATS集团SP品牌和英国Biopharma Group等的紧密合作，致力于促进中国生物医药技术创新升级，助力中国大健康行业的持续发展。莱奥德创在上海及广州设有实验室，拥有专业的技术团队及国内外专家支持体系。莱奥德创面向生物制药、食品科学等各个领域行业客户，提供冻干研发、放大、委托生产及培训等服务。前期研发● 产品配方特征研究:共晶点温度(Te)、塌陷温度(Tc)、玻璃态转化温度(Tg'、Tg)测定等；● 实验室工艺开发：冻干工艺开发:冻干制剂配方开发，工艺确定，申报材料撰写；● 冻干工艺优化：利用中试冻干机上PAT工具优化及缩短工艺；● 冻干产品质量指标测试：水分含量，冻干饼韧度分析；● 咨询服务：如产品外观问题、产品质量问题、其他troubleshooting等；工艺放大/技术转移● 冻干工艺转移/放大: 远程技术指导+现场服务；● 小批量冻干生产(NON-GMP)，临床一期生产（GMP）；其他业务● 企业小团队线上线下培训服务：冻干原理，工艺开发，设备使用维护等；● 冻干设备租赁服务。400-006-9696www.lyoinnovation.com莱奥德创冻干工场中国(上海)自由贸易试验区富特南路215号自贸壹号生命科技产业园4号楼1单元1层1002室德祥科技德祥科技有限公司成立于1992年，总部位于中国香港特别行政区，分别在越南、广州、上海、北京设立分公司。主要服务于大中华区和亚太地区——在亚太地区有27个办事处和销售网点，5个维修中心和2个样机实验室。30多年来，德祥一直深耕于科学仪器行业，主营产品有实验室分析仪器、工业检测仪器及过程控制设备，致力于为新老客户提供更完善的解决方案。公司业务包含仪器代理，维修售后，实验室咨询与规划，CRO冻干工艺开发服务以及自主产品研发、生产、销售、售后。与高校、科研院所、政府机构、检验机构及知名企业保持密切合作，服务客户覆盖制药、医疗、商业实验室、工业、环保、石化、食品饮料和电子等各个行业及领域。德祥始终秉承诚信经营的理念，致力于成为优秀的科学仪器供应商，为此我们从未停止前进的脚步。我们始终相信，每一天都在使这个世界变得更美好！