未知化合物鉴定

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Nature Chemistry上的文章Native mass spectrometry-based metabolomics identifies metal-binding compounds1，文章通讯作者是来自美国加州大学斯卡格斯药学和药物科学学院的Pieter C. Dorrestein教授。生命活动的正常运行离不开金属的帮助，微生物获取金属的一种常见策略是通过生产小分子电离团来结合金属并形成非共价复合物。尽管结合金属的小分子具有各种生理功能和潜在的药学应用，在复杂生物成分（如微生物培养提取物）中找到金属结合化合物仍具有挑战。由于小分子-金属结合位点是多样的，金属结合情况必须通过实验来确定，常用的实验方法有电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、原子吸收光谱（AAS）、X射线荧光光谱（XRF）、紫外-可见吸收光谱和核磁共振（NMR）等方法，这些方法通常通量较低，且在小分子成分不确定和金属种类复杂的情况下无法判断小分子-金属结合情况。为了发现新的小分子-金属复合物，本文开发了一种非靶向LC-MS/MS方法，结合非变性质谱（native MS）和一种新的计算工具离子识别分子网络，通过相关性分析、用户定义的质量差异和MS/MS相似性匹配相关化合物。该方法能够在复杂的生物样品中筛选金属结合化合物，作者把这个方法称为非变性质谱代谢组学。一、非变性代谢组学概念小分子非靶向分析采用的萃取、样品制备和LC-MS/MS方法通常在低pH值、高比例有机相和低金属浓度的条件下，这些条件不利于金属络合。因此作者采用了非变性质谱的实验思路，考察了在较高的pH值下，小分子与金属的结合比例较高，并开发了一个两步非变性ESI-LC-MS/MS工作流程，该流程具备在线柱后pH调节和金属引入的能力（图1），在金属引入后有足够的时间形成小分子-金属复合物。使用MZmine和GNPS中的计算离子身份分子网络（IIMN）来分析数据。该实验流程是作者开发的第二代方法，此前的第一代方法使用的是双管注射泵（double-barrel syringe pump）注射氢氧化铵溶液，随后注射一种或多种金属盐。二代方法与一代的区别在于使用了HPLC二元泵进行乙酸铵溶液的补液过程，使溶剂组成和梯度更稳定。图1. 基于非变性质谱的代谢组学实验流程。二、方法考察作者首先制备了市售的铁载体标准混合物，即耶尔森菌杆菌素（1）、弧菌杆菌素（2）、肠杆菌素（3）、高铁环六肽（7）和红酵母酸（6），编号与图2相对应。标准品通过HPLC分离，然后通过第一代装置进行液相色谱后pH调节和过量（毫摩尔）氯化铁注入，仅在铁注入后观察到每种铁载体的三价铁加合物（图2a）。随后，作者进行了以下的考察：①考察了加和物峰面积呈现铁的浓度依赖性，但不完全与铁载体本身对铁的亲和力相对应，这可能由于每种载体的电喷雾效率不同以及流动相溶液组成的变化，因此作者开发了带有补流泵的第二代装置，可减少由梯度导致的溶剂组成的变化，并将有机溶剂浓度降低约50%。②考察了铁载体与铁的加和是否是非特异性加和，将能与铁结合的高铁色素分子与一系列不能结合铁的其他分子混合，同样实验流程下发现只有高铁色素结合了铁，证明加和物的形成是特异性结合（图2b）。③考察了载体的金属选择性，向载体加入生理水平（微摩尔）的金属混合物，包括铁、铜、钴、镍、锌和锰盐，发现载体对金属的选择性与文献报道一致，例如两种铁载体对铁的选择性都高于其他金属；两个相似的物质的区分，去铁胺B（DFB）可与铜结合，而去铁胺E（DFE）不能。图2. 液相后注入金属法在标准铁载体样品中的测试。接着，作者将此方法应用于谷氨酰杆菌JB182的培养提取物。该微生物是从液体奶酪培养基中分离出来的，而奶酪是一个缺铁的环境。作者利用非变性代谢组学工作流程，从培养提取物中观察到未结合铁的去铁胺E和结合了三价铁的铁胺E。去铁胺E是使用IIMN观察到的唯一结合铁的分子（图3），检测到的其他分子都不是铁结合的。图3. 谷氨酰杆菌JB182培养提取物的非变性代谢组学测试。a. 去铁胺E是使用IIMN观察到的唯一结合铁的分子；b. 标准液相方法鉴定到的去铁胺E大多没有结合金属，其3.03分钟处的MS1为图d；c. 液相后注入铁鉴定到的去铁胺E结合了金属，其3.05分钟处的MS1为图e。作者用同样的方法测试了大肠杆菌Nissle 1917提取物，并在液相后将pH调整为7（模仿大肠杆菌胞质pH），发现了一些结合铁的载体分子（图4a）及其相应的铁复合物（图4b-d），除图4标注的三种，还存在一些yersiniabactin和aerobactin的衍生物也能结合铁，共发现了至少15种额外的铁载体。衍生物的发现也说明了IIMN识别结构相似性的能力，且修饰也通常与生物合成或代谢有关。除了研究生理条件下的铁结合外，作者也尝试鉴定了锌结合分子，因为大肠杆菌Nissle的锌获取机制尚未完全阐明。使用本文的方法，作者发现了yersiniabactin及其许多衍生物也与锌结合，包括HPTzTn-COOH，这种结合也通过NMR进行了辅助验证。由此可推断yersiniabactin通过获取锌来逃避抗菌蛋白对锌的螯合，增强大肠杆菌Nissle在发炎的肠道中繁殖的能力。此外，作者还测试了比大肠杆菌Nissle基因组大十倍的酒用真菌Eutypa lata，也发现了结合铁的分子衍生物（图4e-f）图4. 非变性代谢组学方法用于鉴定细菌和真菌培养提取物。最后，作者将本方法应用到环境样品中，测试该方法是否可以在超复杂样品中识别金属结合化合物。作者分析了2017年6月浮游植物爆发期间在加州海流生态系统中收集的固相萃取的表层海洋样本。表层海水中的溶解有机质（dissolved organic matter，DOM）是十分复杂的样本，在液相后调节pH至8后，鉴定到了软骨藻酸为铜结合分子，与文献报道的一致。IIMN还分析到软骨藻酸以二聚体的形式与铜离子结合（图5），可能以类似于EDTA的构型与铜配位。图5. 非变性代谢组学方法用于鉴定表层海水中的溶解有机质。总结：本文开发的非变性代谢组学方法通过液相后补充金属或调节pH，可以从复杂的样本中识别已知的和新的金属离子载体。1.Aron, A. T. Petras, D. Schmid, R. Gauglitz, J. M. Büttel, I. Antelo, L. Zhi, H. Nuccio, S.-P. Saak, C. C. Malarney, K. P. Thines, E. Dutton, R. J. Aluwihare, L. I. Raffatellu, M. Dorrestein, P. C., Native mass spectrometry-based metabolomics identifies metal-binding compounds. Nature Chemistry 2022, 14 (1), 100-109.

进行代谢组学、环境、法医和食品安全研究的科学家们可以借助一款新型全球通用的网络数据库利用高质量的高分辨率精确质量(HRAM)质谱数据鉴定未知物质。此数据库叫做mzCloud (www.mzCloud.org)，是赛默飞世尔科技与HighChem公司的合作结晶。它是一款支持搜索的新型HRAM质谱数据库。所有高质量的数据来自赛默飞Orbitrap质谱仪。　　&ldquo 集合大家的力量是建立一个结构设置多元化综合数据库的唯一途径。&rdquo HighChem公司CEO Robert Mistrik说。&ldquo 赛默飞和其他合作伙伴的投入使我们有机会为科学研究创造了这样一个功能强大的工具，它还具有直观而简单的网络界面。&rdquo 　　mzCloud为使用质谱鉴定未知物的科学家提供了一个新工具，它能提供多样的化学物质深度信息。另外，对完全未知的物质可采用子离子指纹识别，利用大量质谱数据鉴定结构。　　&ldquo 识别未知物是代谢组学、毒理学、食品安全和环境应用研究的瓶颈之一。很多研究者在鉴定时需要参考碎片数据库，数据库的高质量和多样性是非常必要的。&rdquo 赛默飞数据库技术经理Tim Stratton说。&ldquo 把在质谱和化合物方面的资源与HighChem的化学结构知识相结合，我们创造了一个能帮助科学家鉴定未知化合物的碎片数据库。&rdquo 　　mzCloud将在第十一届代谢组学国际会议(2015年 美国三藩市)上展示。编译：郭浩楠

目的在使用飞行时间质谱对环境水源进行广泛的农药筛查的过程中，成功鉴定天然河水中发现的一种非目标未知污染物。背景TOF筛查常用于目标筛查工作；在这种情况下，一种全面的数据库用于在筛查采集过程中将关键的目标化合物作为目标。当分析环境水源时，农药污染筛查是最重要分析之一。然而，诸如兽药或人用药品及其代谢物等其他污染物种类可能也以和农药类似的超微量水平存在并能对水生生态系统造成同等危害。发现一种非目标化合物后，需要对其进行确认和鉴定。TOF仪器必须足够灵敏和准确，从而确保未知化合物能被正确检出和鉴定，同时又能保持极低浓度组分的质量准确性。关于低能量前体离子和MSE高能量碎片离子的精准质量数据以及较窄的色谱提取窗口都为非目标种类的鉴定提供了更高的可信度。解决方案Waters Xevo&trade G2 QTof连同ACQUITY UPLC和ChromaLynxTMXS数据处理软件用于快速筛查经Oasis HLB柱萃取后的天然河水。该方案使用一种总运行时间为五分钟的UPLC通用筛查梯度。所用的流动相为10 mM醋酸铵水溶液和10mM的醋酸铵甲醇溶液。对河水空白基质进行了筛查，以研究可能存在的任何本底污染。经ChromaLynx XS软件去卷积后，在2.44分钟处发现了离子m/z 237.1031的一个明显色谱峰，如图1所示。Xevo G2 QTof采集得到的精确而可重现的准确质量数据为分析师提供了一种非目标污染物筛查和研究的解决方案，这种解决方案结果具有较高可信度。当这种准确质量离子使用MassLynxTM应用管理系统内的元素组成工具进行分析时，最大质量公差为2.0ppm的最有可能的建议分子式为C15H13N2O，并且通过使用i-FIT TM 而将该分子式选定为最佳拟合。该分子式与一种人用抗惊厥和情绪稳定药物质子化卡巴咪嗪相匹配。然后，在2.44分钟采集的低能量质谱和MSE高能量质谱使用MassFragmentTM 工具进行处理，并与卡巴咪嗪的母体分子及其初级碎片离子相匹配，如图2所示。最后，通过与纯卡巴咪嗪的溶剂标准溶液比较而得到了明确确认。图3所示的溶剂标准品数据与非目标污染物数据建立了一个匹配，从而清晰地证明了这种非预期化合物就是卡巴咪嗪。总结由Oasis HLB SPE萃取、通过ACQUITY UPLC快速分离并由Xevo G2 Qtof进行检测、以及接下来的ChromaLynx MS软件进行数据处理的一整套流程可成功用于天然河水的筛查。使用一种非目标筛查方法实现了对非预期污染物&mdash 药物分子卡巴咪嗪&mdash 的检测和鉴定。Xevo G2 QTof采集的精确而可重现的准确质量数据实现了母离子和碎片离子结构的明确分配。该方法为分析师提供了一种最终结果具有较高可信度的非目标化合物的筛查和研究解决方案。