本试剂采用稳定高效的RT-PCR预混体系,是以RNA为模板进行一步法RT-PCR的专用试剂。其原理为用基因特异性引物进行反转录反应,获得第一链cDNA(不可使用Oligo(dT)或Random Rimer合成第一链cDNA),再使用基因特异性正向引物和反向引物进行PCR扩增,在同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部过程。反应体系中已含有电泳所需的指试剂(蓝色和黄色),反应后可以直接进行电泳。
在本试剂中,将耐热M-MLV反转录酶、Rnase Inhibitor、Hotstart高保真DNA聚合酶以及稳定剂等配制成50×One-Step Enzyme Mix预混液;反应Buffer、dNTP以及电泳指示染料配制成5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer,因此使得操作更加简单便,扩增产物可用于平端克隆和DNA测序。
注意:1.50×One-Step Enzyme Mix粘度高,第一次使用之前要离心收集至反应管底部,吸取时应缓慢小心。
2.由于使用了Hotstart高保真DNA聚合酶,反应配制可在常温进行,但各组分应-20°C保存。
主要特征
耐热M-MLV反转录酶可在55℃反应能更好的打开复杂二级结构,只需10min即可完成逆转录。
DNA聚合酶为热启动型高保真酶,能够有效的抑制非特异性反应且具有较高的校正活性,酶激活仅需2min。
具有宽泛的模板量兼容性,10 ng~1μg都可有效扩增。
反应过程中无需开盖,避免了操作过程中的污染危害。
储存
请置于-20°C,可保存2年;避免反复冻融。
应用实例1:在以A3824-03或 A3828-03,用 LP1002引物组进行的LAMP测试。Bst4.0 SYBR Green试剂可在标准定量PCR仪或恒温荧光仪上进行反应。以体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies,NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应25min的检测结果,可以看到检测反应<20min(达平台期)。
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应用实例2: 用 LP1002引物组进行的LAMP测试。OG变色法为终点变色策略,在反应结束后,倒置反应管,溶解管盖上染料后,阳性样本呈现出醒目的绿色,阴性表现出橙色,区分明显。且该方法不受样本类型限制,杂质耐受性很好。以体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies,NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应20min后检测结果。
![](https://img1.17img.cn/17img/images/202408/uepic/1ab7e4d0-ee4e-4ac0-a331-5e5047ebd645.jpg)
应用实例3:采用荧光酶活测定法在30℃和60℃条件下测定HotStart Bst 4.2,结果显示与未加入Aptamer的对照比较来看。HotStart Bst 4.2在30℃条件下酶活几乎无活性,而60℃条件下1min内酶活完全释放,恢复100%活性
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