丙酮酸激酶(PK)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
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溶液的配制:
1、 试剂二:临用前在试剂二瓶中加入 17mL 试剂一和 1mL 蒸馏水充分溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)水浴 5 分钟,现配现用;
2、 试剂三:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂三:蒸馏水为 17:1000 的体积比例充分混匀,冰上放置备用,现用现配。
产品说明:
PK(EC 2.7.1.40)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化糖酵解过程中的最 后一步反应,是糖酵解过程中的主要限速酶之一,也是产生ATP的关键酶之一,因此测定PK活性具有重要意义。
PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸,乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PK活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 细菌或培养细胞:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个)提取液体积(mL)为 500-1000:1的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或者 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2. 组织:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5-10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3. 血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定:
在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三和 180μL 试剂二,混匀,立即记录 340nm处 20s 时的吸光值A1和 2min 20s 后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
三、PK 活性计算
![image 2022060702205849851](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060702205849851.png)
注意事项:
1.测定过程中试剂三、样本在冰上放置,以免变性和失活。
2.比色皿中反应液的温度尽量保持37℃或25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。或酶标板放入37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)恒温培养箱中孵育。
3.最 好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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