羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒 微量法

羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1. 提取液：自备 6 mol/L 盐酸，提供一个 125mL 空瓶。6 mol/L 盐酸的配制：浓盐酸（37%）和 H2O 的体积比是 1：1。

2. 标准品：0.5 mg/mL 羟脯氨酸标准品。

产品说明：

HYP 是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此 HYP 含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。

样本经水解产生游离的 HYP，进一步被氯胺 T 氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在 560nm 处有特征吸收峰。通过测定样本水解液 560nm 吸光值，可计算 HYP 含量。

技术指标：

最 低检出限：0.057 μg/mL

线性范围：0.117-30 μg/mL

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

天平、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、6mol/L 盐酸和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：称取约 0.2g 样本于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入 2mL 的提取液，煮沸或 110℃烘箱 2 至 6 小时消化至没有可见大的团块，冷却后用 10mol/L NaOH（约 1mL）调节 pH 值至 6-8 范围内（不可过酸或过碱），再蒸馏水定容至 4mL。最后 16000rpm，25℃，离心 20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质，不影响实验）

2. 细胞：取 500 万个细胞，加入 1mL 的提取液，煮沸或 110℃烘箱 2 至 6 小时消化至透明状，冷却后用 10mol/LNaOH（约 0.5mL）调节 pH 值至 6-8 范围内（不可过酸或过碱），蒸馏水定容至 2mL，16000rpm，25℃，离心 20min，取上清待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 560nm，蒸馏水调零。

2、 将标准品用蒸馏水稀释为 30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234 μg/mL 的标准溶液。

3、 按下表进行操作：

三、羟脯氨酸含量计算公式

注意事项：

1、 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

2、 试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。

3、按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定。

实验实例：

1、 取 0.2g 小鼠腿进行样本处理，取上清后按测定步骤操作，使用 96 孔板测得计算 ΔA=A 测定管-A 空白管=0.177-0.06=0.117，带入标准曲线 y=0.0383x+0.022，计算 x=2.48，按样本质量计算含量得：

组织羟脯氨酸含量（μg/g 质量）=4x÷W=4×2.48÷0.2=49.6 μg/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！