ATP含量检测试剂盒微量法 微量法

ATP 含量检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 提取液：低温条件下，可能有结晶析出，放于 60℃水浴加热溶解即可，不影响使用。

2、 试剂二：临用前加入 3.5 mL 蒸馏水充分溶解，可加热促进溶解；

3、 试剂四：临用前取 1 支加入 0.2 mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存 2 周，避免反复冻融；

4、 试剂五：临用前加入 1 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；

5、 试剂六：临用前取 1 支加入 0.25 mL 蒸馏水备用，用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；

6、 标准品：5 mg ATP。临用前加入 0.826 mL 蒸馏水配成 10 μmol/mL 的 ATP 标准溶液，用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；

7、 工作液的配制：临用前请按试剂二(mL)：试剂三(mL)：试剂四(mL)：试剂五(mL)：试剂六(mL)=0.2：0.2：0.02：0.08：0.02 的比例配制（0.52mL，约 10T 的量），现配现用。

产品说明：

ATP 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物能量通货，能荷是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定 ATP 含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。

HK 催化葡萄糖和 ATP 合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成 NADPH，NADPH 在 340nm 有特征吸收峰，NADPH 和 ATP 含量成正比，以此反应 ATP 含量。

技术指标：

最 低检出限：0.0026 μmol/mL

线性范围：0.01953-3 μmol/mL

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、低温离心机、可调式移液枪、微量石英比色皿/ 96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、蒸馏水、冰和氯仿。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 血清（浆）中 ATP 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL血清（浆），加入 1mL 提取液），充分震荡，10000g，4℃离心 10min；取上清液至另一 EP 管中，加入 500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心 3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

2、 组织中 ATP 的提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液），进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心 10min，取上清至另一 EP 管中，加入 500μL 的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心 3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

3、 细胞或细菌中 ATP 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超声 2s，停 1s，总时间 1min），10000g 4 ℃离心 10min；取上清液至另一 EP 管中，加入500μL 的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心 3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

注：以上提取过程严格控制在冰浴条件下进行。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 340nm，分光光度计用蒸馏水调零。

1、 标准溶液的稀释：取 100μL 10μmol/mLATP 标准溶液，加入 1.5mL 蒸馏水，充分混匀，配制成 0.625μmol/mL标准液使用，现用现配。（实验中每管需要 20μL，为减小实验误差，故配制大体积。）

2、 加样表：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入

三、ATP 含量计算

1、 血清（浆）中 ATP 含量计算

ATP 含量(μmol/mL) =ΔA 测定÷（ΔA 标准÷C 标准）×（V 提取+V 血清（浆））÷V 血清（浆）

 =6.875×ΔA 测定÷ΔA 标准

2、 组织、细菌或细胞中 ATP 含量计算

（1） 按样本质量计算

ATP 含量（μmol/g 质量）= ΔA 测定÷（ΔA 标准÷C 标准）×V 提取÷W

=0.625×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W

（2） 按细菌或细胞数量计算

ATP 含量(μmol/10⁶ cell）=ΔA 测定÷（ΔA 标准÷C 标准）×V 提取÷5

=0.125×ΔA 测定÷ΔA 标准

C 标准：标准液浓度，0.625μmol/mL；V 提取：加入的提取液体积，1mL；V 血清（血浆）：血清（浆）体积，0.1mL；W：样本质量，g；5：细胞或细菌总数，5×10⁶个。

注意事项：

1、 加入提取液离心后的上清若为浑浊为正常现象。

2、 如果吸光值大于 1.5，建议将样本用提取液稀释后进行测定。注意计算公式中乘以稀释倍数；如果吸光值过低或接近空白，建议加大样本量后进行测定，注意同步修改计算公式。

实验实例：

1、 取 0.1g 兔肺脏加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心 10min，取上清至另一 EP 管中，加入 500μL 的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心 3min，取上清，置冰上按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定=A2 测定-A1 测定=0.0873-0.065=0.0223，ΔA 标准=A2 标准-A1 标准=0.4368-0.1435=0.2933，按样本质量计算含量得：

ATP 含量（μmol/g 质量）=0.625×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W=0.625×0.0223÷0.2933÷0.1=0.475 μmol/g 质量。

2、 取 0.1g 稗草加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心 10min，取上清至另一 EP 管中，加入 500μL 的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心 3min，取上清，置冰上按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算ΔA 测定=A2 测定-A1 测定=0.5351-0.4969=0.0382，ΔA 标准=A2 标准-A1 标准=0.4368-0.1435=0.2933，按样本质量计算含量得：

ATP 含量（μmol/g 质量）=0.625×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W=0.625×0.0382÷0.2933÷0.1=0.814 μmol/g 质量。

3、 取血清 0.1mL 加入 1mL 提取液，充分震荡，10000g，4℃离心 10min；取上清液至另一 EP 管中，加入 500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心 3min，取上清置冰上，使用微量石英比色皿测得计算，ΔA 测定=A2 测定-A1 测定=0.0569-0.0449=0.012，ΔA 标准=A2 标准-A1 标准=0.4368-0.1435=0.2933，按液体体积计算含量得：ATP 含量(μmol/mL) =6.875×ΔA 测定÷ΔA 标准=6.875×0.012÷0.2933=0.281 μmol/mL。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！