只需将校准板放在 NT8 上，即可让系统使用激光辅助校准系统进行自动调整。了解更多：https://hubs.ly/Q01t1kd90

F.A.S.T.纳升级移液工作站的计算机视觉技术使其能够扫描移液吸头盒以确定所有吸头的数量和位置。这样便无需手动重新排列吸头，降低了污染风险。了解更多：https://hubs.ly/Q01sXR8r0

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会议介绍由中国生物物理学会、中国晶体学会、中山大学医学院、中国科学院深圳理工大学（筹）联合主办的“2022年第九届华南结构生物学论坛暨医药合成生物产业创新大会（The 9th South China Structural Biology Symposium 2022 & Medicine Synthetic Biology Industry Innovation Convention）“ 将于2022年11月18—20日在深圳市光明云谷国际会议中心举行。此次论坛是结构生物学领域同行学者加强学术交流、增加合作契机及加深友谊的高层次学术交流会议。会议将邀请国内外著名学者，以结构生物学为主题，研讨蛋白质结构与功能机制、结构药理、蛋白设计与预测、新技术新方法等内容，深入交流近年来在生物学及其交叉领域取得的新进展、新技术和新经验，并重视产业应用和青年人才。 会议时间、地点时间：2022年11月18—20日地点：深圳市光明云谷国际会议中心展位号 - Z9展示的产品NT8 自动点晶系统/结晶机器人µPULSE【新品预告】µPULSE® - TFF 研究级全自动多用途切向流过滤系统，体积小，速度快，样品浓缩、缓冲液置换、脱盐

第十九届中国国际检验医学暨输血仪器试剂博览会（CACLP）、第二届中国国际IVD上游原材料制造暨流通供应链博览会（CISCE）将于2022年10月26日-28日在南昌绿地国际博览中心举行。CACLP是体外诊断领域中极具影响力、聚集力的专业性展览盛会。参展产品涵盖：体液、生物化学、免疫、分子与核酸、微生物、POCT、上游原材料等领域全部产品。展会信息展会名称：第十九届中国国际检验医学暨输血仪器试剂博览会（CACLP）、第二届中国国际IVD上游原材料制造暨流通供应链博览会（CISCE）主办单位：展会时间：2022年10月26日-10月28日展会地点：南昌绿地国际博览中心展会地址：南昌市红谷滩新区怀玉山大道1315号展位号 - B3-2918

根据9月7日国务院常务会议精神，对部分领域设备更新改造贷款阶段性财政贴息和加大社会服务业信贷支持，促进消费发挥主拉动作用。对医院等设备购置和更新改造新增贷款，实施阶段性鼓励政策，中央财政贴息2.5个百分点，期限2年，申请贴息截至今年12月31日。FORMULATRIX 作为全球全自动微量移液的行业领导者，从公司2002年建立初始，便一直秉持为科研工作者提供高质量产品和高水平服务、为全球科研发展助力的信念。值此政策之际，我们为用户提供了四款适合不同应用场景和不同预算的移液产品。我们的移液产品经过几十年的硬件打磨和软件更新，吸收了众多前线科研工作者的使用反馈和意见，在生物制药、分子生物、细胞生物等研究领域给予了用户坚定选择我们产品的理由。

9月19日至20日我们参加了在上海举办的细胞产业大会暨 2022 第八届（上海）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛。感谢主办方的安排，感谢受邀前来朋友的支持，也感谢会上行业专家们的指导和帮助。会上我们积极参与了主办方组织的线上主播活动，在这里分享我们在现场的介绍短片。同时，为了更好地服务我们的客户，我们在微信公众号里增加了一个内容板块，在该板块内我们会及时分享和更新我们的线上webinar视频，方便对我们产品感兴趣的老师们随时查看。现在可以点击“资料信息”按键选择“Webinar”，即可进入我们的webinar视频页面。具体操作页面如下所示。

SCoPE2 (Single-Cell ProtEomics 2) 1 方法旨在使用现有可获得的试剂和技术实现高通量单细胞蛋白质组学。这一方法比 SCoPE-MS2 更优， 体现在 SCoPE2 能够将裂解量减少 10 倍，从 10 μL 减少到 1 μL，从而将耗材和设备的成本降低 100 倍以上，并通过并行处理将样品制备的通量提高 100 倍以上。用于单细胞质谱分析的SCoPE2样品制备产品介绍MANTIS®（绿螳）是一台可编程，纳升级别微量移液，低死体积，非接触式自动分液设备；它可以稳定的分液各种液体，包括一些高黏度液体，例如细胞、蛋白、酶、引物、底物甚至液态微珠。主要特性低死腔量 – 移液工作中管路的死腔液量会造成试剂的巨大浪费。Mantis可以缩小死腔量到6微升。洁净 – 液体通路可以重复使用，也可以一次性使用。可靠 – 非接触微隔膜技术，主动排液方法移液，杜绝了阻塞的风险。灵活 – Mantis可以移液标准24孔、96、384、1536孔板，也可以轻松快速地定义客户自创的非标准孔板。化学兼容性 – Mantis可以选配全氟橡胶的管路和芯片，移液DMSO以及其它各种强腐蚀性的液体。广泛应用• 试验设计/试剂开发      • NGS文库制备                 • PCR/qPCR• 细胞分液                      • 免疫分析                        • 微珠应用

2022 细胞产业大会暨 2022 第八届（上海）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛将于9月19日正式开始。届时我们将在展位 507 号静待各位的来临。会议简介本次峰会紧密围绕政策规范、监管、工艺与产业化进展、干细胞临床前研究与临床应用转化、干细胞存储与治疗、肿瘤免疫治疗、细胞与基因治疗、通用型CAR-T细胞治疗、单细胞多组学、单细胞测序、细胞外囊泡分离及检测、3D细胞培养与类器官、基因治疗及溶瘤病毒、实体瘤治疗及药物开发、临床研究与治疗进展等话题，特邀来自国家药品审评监管机构、科研院所、医疗机构、创新药企、生物治疗、生物技术和服务企业、产业链上下游企业、产业园区、投资机构、行业协会等多位权威专家与产业先锋进行分享交流及产品展示。会议地点上海建工浦江皇冠假日酒店（1楼+2楼）展位号 - 507现场展示的产品MANTISMANTIS®液体处理器F.A.S.T.【新品预告】F.A.S.T. - 纳升级移液工作站µPULSE【新品预告】µPULSE® - TFF 研究级全自动多用途切向流过滤系统，体积小，速度快，样品浓缩、缓冲液置换、脱盐

无论用户使用的是可溶性蛋白还是膜蛋白，都需要筛选和优化众多结晶条件，以找到合适的结晶条件。在脂质立方相 (LCP) 中成功结晶的主要因素之一是蛋白质在脂质双层内扩散的能力。蛋白质的扩散速率受蛋白质聚集、LCP 的结构特性和化学环境的影响。扩散速率可以通过光漂白后的荧光恢复 (FRAP) 来确定，它测量标记蛋白的荧光强度在经过光漂白的 LCP 液滴中的一小块区域内重新恢复所需的时间量（图1）。用户可以绘制和分析归一化荧光强度与时间的曲线，以量化两个与蛋白扩散相关的特性：迁移率（强度曲线渐近接近的值）和扩散速率（与曲线起点处的斜率成比例） 。图 1. 1) 以预漂白样品图像作为基线荧光强度；2) 样品通过一个小的（~15 微米直径）激光光斑进行光漂白。3) 随着漂白分子向外扩散和新分子向内扩散，监测该漂白点内的荧光强度。自动化 LCP-FRAP 仪器最初由斯克里普斯研究所开发，现在由 FORMULATRIX® 生产，极大地加快了LCP 板的筛选过程。用户使用 FRAP 进行筛选，无需等待数天到数周来确定晶体是否已形成， FRAP 给予了使用者即时观察，以此判断条件是否最适合结晶，同时排除那些由于扩散速率不高而不会形成结晶的条件。虽然整个 FRAP 过程仍然相对缓慢，每个蛋白液滴需要花 15-20 分钟才能完成，但这样需要的蛋白质量相对较少。一种能够避免每个 LCP-FRAP 样本的数据采集时间过长的方法便是仅收集终态荧光强度。FRAP 系统通过使用这种三点数据收集方法（图 2），可以依次漂白所有 96 个孔，然后返回收集荧光恢复图像。虽然这种方法只能恢复样本的迁移率，但研究人员仍然能够仅依靠迁移率分析来识别潜在的结晶样本。图 2. 高通量 FRAP 方法仅用于收集最终状态荧光强度以确定样本迁移率结果。利用图 3 所示的工作流程，FORMULATRIX 的 RockImager-FRAP 可以在 50 分钟内完成 96 孔 FRAP 数据采集。图 3. 高通量 LCP-FRAP 数据采集流程图整块结晶板的 FRAP 迁移率数据可以分组到具有颜色编码背景的画布视图中，以便用户快速识别结晶孔（图 4）。然后，研究人员可以与软件进行交互，将孔标记为结晶或非结晶。在大多数情况下，仅迁移恢复数据就足以让研究人员识别潜在的结晶生成条件。尽管如此，人们可能仍希望生成完整的恢复曲线来检查曲线形状并确定扩散速率。为避免通过完全恢复运行所有 96 个样本，此过程仅适用于用户在三点高通量 FRAP 分析期间指定的那些潜在结晶生成孔。图 4. 收集的 FRAP 迁移率数据显示在画布视图中，颜色编码用于快速识别有无结晶生成可能。可以绘制完整的强度恢复曲线并用贝塞尔函数拟合以得出扩散速率和恢复时间。在大多数情况下，单个 Bessel 函数足以实现低残差拟合结果。在其余的大多数情况下，两种不同类型的分子同时扩散。这通常是因为蛋白质没有被充分纯化，而脂质和蛋白质分子都被荧光染料标记。较小分子量的脂质比大蛋白质分子扩散得快得多。在这种情况下，必须使用双分量 Bessel 函数拟合来准确模拟两种不同的扩散速率。

问题：生物晶体的明确和可靠鉴定仍然是晶体学研究的主要障碍，尤其是在初始筛选实验的关键阶段。而在可见光范围内以高分辨率自动成像通常不足以识别能够或可能形成晶体的所有条件。微量荧光标记内在荧光主要取决于天然存在的色氨酸的量，而一种可能克服内在荧光缺点的办法是微量荧光标记 (TFL)。已确定的实验方案包括在结晶前立即用各种荧光染料快速标记 0.1% 的样品。多重标记除了与固有荧光相比显着增强的信噪比外，还可用于验证晶体中多亚基复合物的存在。使用 MFI 对晶体进行灵敏检测紫外光和 TFL 成像成为了晶体检测的替代工具。多荧光成像 (MFI) 提供了可供用户选择的 3 种不同波长下成像的灵活性，包括紫外和可见荧光，以轻松检测蛋白质晶体，即使是那些掩埋在沉淀下的晶体。紫外光通过紫外成像照射蛋白液滴，由芳香族氨基酸（如色氨酸）产生的荧光被检测到以创建图像。通过仅用荧光团标记 0.1% 的样品，TFL 还能够检测几乎不含色氨酸的蛋白质。发现蛋白质-蛋白质复合物借助多荧光成像 (MFI)，用户现在可以区分蛋白质-蛋白质复合物的晶体和单一蛋白质的晶体。简单来说，先用两种不同的胺活性染料标记两种可疑的蛋白质或亚基，然后在两个相应的波长下对液滴进行成像。在两种波长上都发出荧光的晶体是蛋白质-蛋白质复合物，而那些只在一种波长上发出荧光的晶体是单一蛋白质。大范围的放大倍率借助 3 个物镜，用户可以缩小以查看整个液滴或放大以更详细地查看晶体。9MP 图像的数字缩放能让用户将 FOV 直接与可见图像匹配。3 种不同的波长下的成像用户可以选择多达 3 种不同的光波长来对晶体进行成像，包括紫外线和各种可见光波长。可互换的滤光片模块能够最大限度地提高图像质量和染料标签的兼容性。一次最多可以安装三个过滤器模块，并且可以轻松切换。默认滤光片配置包括：UV 荧光、荧光素和 Texas 红滤光片组。持久的快速和安全标记简单的 0.1% 蛋白质标记方案制备 5mM 琥珀酰亚胺酯染料在 DMSO 中的储备溶液。假设对胺残基的化学计量标记效率为 1:1，则在蛋白质溶液中加入适量的染料，以 0.1% 标记赖氨酸残基。等待 5 分钟，此时 90% 的染料被结合。无需纯化，且样品在 120 天后仍有荧光。已证明用荧光团标记蛋白质对结晶没有已知的负面影响，并且其被证明是一种有效识别蛋白质结晶的方法。

存在的问题：完整膜蛋白结晶最佳条件的发现对于研究者而言非常耗时。晶体可能需要两周或更长时间才能形成，这使得优化结晶生长条件的过程极其漫长。光漂白后的荧光恢复 (FRAP)预筛选结晶条件以消除那些不利于结晶的条件。用户可以在短短 30 分钟内将这些条件缩小范围至一小部分利于结晶的条件。如果蛋白质不能在脂质立方相中扩散，那么它们就不可能形成晶体。FRAP 系统可以检查蛋白质制剂，节省用户时间为获得完整的膜蛋白，FRAP 在广泛不同的盐晶条件下对 96 孔板进行检测。在大多数条件下良好的光漂白荧光恢复意味值得用该样品进行 LCP 结晶。FRAP 可以用来确定哪种蛋白质制剂最好我们使用两种不同的去污剂对一个完整的膜蛋白进行纯化，因此在广泛的结晶条件下 FRAP 荧光恢复存在显著差异。这里 LDAO 被证明是一种更适合纯化的去污剂，应该用于结晶试验。如果在 SDS 中纯化的蛋白质几乎没有迁移率，那么它就不会结晶。在 30 分钟内筛选 96 种结晶条件FRAP 能够自动分析 96 孔 LCP 板以确定每个液滴的迁移率。每个孔都通过聚焦的激光点进行光漂白，并测量固定时间点后的荧光恢复。而在液滴中可迁移的蛋白质百分比表明是否可能发生结晶。FRAP 成像仪发射光漂白激光脉冲，该脉冲从二向色镜反射，通过激发滤光片，再被第二个二向色镜反射，从而漂白样品。LED 通过聚光镜照射光线，光线沿着与激光相同的路径，照亮样品。接着处理荧光图像以确定表明蛋白质迁移率的光漂白点的恢复时间。数据分析容易系统提供的软件组用于跟踪和分析每个实验的得分。得分以颜色编码的概览显示，让用户一眼就能识别出结晶孔。用户可以在软件中对结晶孔进行标记，以备日后参考。在上面的例子中，H8 孔蛋白迁移率最高，最有可能生长晶体。D12 孔迁移率为零，最不可能生长晶体。

关于 SONICCSONICC，即为非对称晶体的二阶非线性成像，其使用飞秒脉冲激光将在大多数蛋白质晶体中发现的倍频效应加以运用，并产生具有可忽略不计背景信号的高对比度图像。SONICC 有两种成像方法，二次谐波产生 (SHG) 和紫外双光子激发荧光 (UV-TPEF)。SHG 通道探测结晶度且UV-TPEF 通道专门针对蛋白质样品。SONICC 成像SONICC 可用于自动筛选所有类型的结晶板，以主动识别各种大小晶体。它特别适用于检测埋藏在沉淀或混浊基质中的晶体，例如脂质立方相 (LCP)。LCP 通常用于结晶膜蛋白，初始筛选会导致在混浊 LCP 基质中出现不易识别的小晶体。SONICC 特别适合在 LCP 中成像，因为即使存在混浊基质，它也可以检测到小晶体。自动成像工具（例如液滴定位和自动对焦）均用于快速准确地找到 LCP 液滴。交叉偏振成像带来的可见成像技术在极快的成像时间内给用户提供了额外信息。微晶检测SONICC 可以检测小于 400 nm 大小的晶体，因此非常适合对在传统技术下难以成像的蛋白质晶体进行成像。亚利桑那州立大学 Fromme 实验室在纳米晶体学方面的最新进展表明，需要一种替代技术来表征含有亚微米晶体的蛋白质样品。他们与 ASU 的 Ross 合作，使用 SONICC 对微流体通道中的蛋白质晶体进行成像。轻松找到结晶鲜明的黑白图像使得用户能够在 96 孔视图中轻松发现结晶，甚至微晶，从而减少查看图像所花费的时间。

SONICC®（非对称晶体的二阶非线性成像）使用飞秒脉冲激光将大多数活性药物成分 (API) 产生的倍频效应加以运用，与传统技术相比，其灵敏度提高了 2 个数量级。前所未有的结晶灵敏度SONICC 是与普渡大学合作开发的，具有前所未有的结晶 API 检测限。SONICC 可以检测到 0.01% 的结晶度，而粉末 X 射线衍射只能检测到样品中低至 1% 的结晶度。这样检测限的提高能够让用户更早地分析样品和更好地理解配方，如此大的提升令人难以置信。SONICC 能够创建粉末和片剂的 3D 重建，以便分析结晶材料的空间分布。结晶度的低定量SONICC 能够对结晶度进行定量，且定量至少比 PXRD 低 2 个数量级。SONICC 对非对称晶体的选择性能让用户检测到固体分散体中低至 0.01% 的结晶材料。此处显示了灰黄霉素样品的 XRD 与 SONICC 作为低温研磨时间的函数的比较。纯结晶灰黄霉素的 X 射线衍射数据（左）和相对 SHG 信号（中）作为低温研磨时间的函数。XRD 和 SHG 的百分比结晶度与低温研磨时间的对数图（右）晶体材料空间分布的可视化SONICC 是一种显微技术，可让人们观察样品中结晶材料的分布。SONICC 可以观察到样品 400 μm 深处，还可以对粉末或片剂进行 3D 成像。掺入不同量结晶灰黄霉素的粉末分散体的 SONICC 图像。每张图像为 2mm²，在 500 毫秒内采集。

SONICC®（非对称晶体的二阶非线性成像）是一种新颖的成像技术，在量化小分子结晶度方面提供了前所未有的灵敏度。SONICC 可用于检测无定形固体分散体中低至 0.03% 的结晶 API 浓度。其分析速度快（小于 1 秒），无需制备样品，且分析可以在存在赋形剂的情况下以最终形式进行。无定形固体分散体药物中活性药物成分 (API) 的生物利用度通常与 API 分子本身的溶解度密切相关。当存在这种分子的多晶型时，最稳定的分子形式通常是结晶型。可惜的是，这种结晶多晶型物通常也是最难溶解的。在这种情况下，需要开发基于 API 的无定形形式的配方，通过添加精确的添加剂组合来获得稳定性。聚合物和其他赋形剂以不同的量使用以形成稳定的制剂，从而延缓更易溶解的无定形 API 转化为其较难溶解的结晶形式。出于优化的目的，这些配方经受各种应力（温度、湿度等）以模拟加速老化，同时进行监测以确保它们保持无定形，从而保持其溶解特性。分析配方中 API 状态的常用技术包括 X 射线粉末衍射、双折射、拉曼显微镜和量热法。这些技术在灵敏度和选择性之间都有着各自的平衡，X 射线衍射通常被认为是功能最强大的；其通常观察到结晶度低至 1-2% 的检测限。偏光显微镜 (PLM) 可提供低至单粒子状态的较低检测限，但它缺乏选择性。所有晶体（包括赋形剂晶体）都将使用 PLM 检测，因此无法分析片剂剂型中的配方。SONICC 带来前所未有的灵敏度最近由普渡大学的 Garth Simpson 教授所开发的一种名为 SONICC（非对称晶体的二阶非线性光学成像）的新表征技术，由 Formulatrix 独家授权代理，该技术为非对称晶体研究带来了前所未有的灵敏度，目前已证明该技术定量限 (LOQ) ) 低至 0.03% 的结晶度。1,2 SONICC 使用多光子显微镜选择性地检测非对称晶体，不受无定形或非手性材料的干扰。SONICC 依赖于二次谐波 (SHG)，其中两个低能量光子在强电场下结合形成更高能量的光子。而这个过程只发生在非中心对称有序晶体中。因此，信号仅在非对称晶体存在的情况下产生；背景信号极低，导致非对称结晶小分子具有极好的检测限。SONICC 用于绝对定量对特定配方中的结晶 API 进行定量可以深入了解配方的稳定性，并有助于确定其在稳定 API 方面的有效性。SONICC 使用校准标准，可以确定未知样品中结晶材料的浓度。为了验证此概念，在无定形灰黄霉素和共聚维酮片剂中加入不同量的结晶灰黄霉素。我们绘制了 SONICC 响应与加标量的校准曲线，并与直线拟合（图 1）。以重量计 2% 的结晶材料制备测试样品，并用 SONICC 一式三份进行分析。使用图 1 所示的校准曲线，测试样品的结晶度确定为 1.6% +/- 0.3%。精确到 2% 的样品制备并非易事，并且是这些测量中最大的误差来源。其中一种标准片剂的 SHG 图像如图 4 所示。从显微镜图像中可以明显看出，结晶灰黄霉素在片剂中分布不均匀，从而导致测试样品分析出现错误。图 1. 加标已知量结晶灰黄霉素的无定形灰黄霉素/共聚维酮片剂的 SONICC 响应与 % 结晶度的校准曲线。在一项研究中证明了 LOQ 比粉末 X 射线衍射 (PXRD) 提高了一个数量级，其中纯结晶灰黄霉素样品在冷冻研磨时间增加后用 SONICC 和 XRD 进行分析。如图 2 所示，冷冻研磨 1 小时后，PXRD 无法再检测到任何结晶材料，而 3 小时后，SONICC 仍检测到 0.05% 的结晶材料存在。2 使用 SONICC 对 LOQ 的这一数量级改进使得其能够评估结晶度低的样品，并能够分析低载药量的样品。图 2. 结晶灰黄霉素样品的相对结晶度与低温研磨时间的关系。2SONICC 用于相对定量获得样品中 API 结晶程度的绝对定量并不总是可行或必要的。通常，样品之间的相对差异足以评估各种配方。例如，在压力和非压力条件下分析了不同载药浓度的药物配方（出于专有原因未公开）。这个特殊的案例研究适用于载药量非常低（0.03% 和 3.2% 药物浓度）的样品，使用 PXRD 等传统技术不容易评估。如图 3 所示，SONICC 可以很容易地识别出不同配方之间结晶度百分比的相对差异。即使样品仅含有 0.03% API，SONICC 仍然可以区分受压样品和未受压样品。SONICC 还能分析得出，与安慰剂和 0.03% 的无应力样品相比，3.2% 浓度的无应力样品存在显着的结晶物质。图 3. 在压力和非压力条件下，不同载药量（0.03% 和 3.2%）的药物配方的相对 SHG 响应。SONICC 提供空间分布信息SONICC 是一种成像技术，它提供了有关样品中结晶药物空间分布的有用信息。而这在评估各种混合技术时特别有用。例如，用无定形灰黄霉素、共聚维酮和少量结晶灰黄霉素制备粉末样品。在图 4 中可以看到 SONICC 成像，其中可以在分散体中识别出一大块结晶材料。我们能在 500 ms 内获得 3um x,y 分辨率的 2mm 正方形图像。由于 SONICC 是一种多光子技术，可以在 z 方向以 ~30 μm 的分辨率实现高达 500 μm 的深度穿透。灰黄霉素/共聚维酮片剂的 3-D 效果图如图 5 所示。这对于分析带有包衣的片剂特别有用。SONICC 可以穿透涂层并提供有关药物如何定位以及它是结晶还是无定形形式的信息。图 4. 无定形灰黄霉素/共聚维酮片剂中结晶灰黄霉素的 SONICC 成像。图 5. 无定形灰黄霉素/共聚维酮片剂中结晶灰黄霉素的 SONIC 3D 渲染。SONICC 也可用于检测紫外激发荧光的模式。这对于可视化 API（以结晶或无定形形式）在配方中的位置特别有用。紫外荧光模式是特定于分子的，例如发出荧光但对结晶度没有选择性的 API。结合晶体特异性 SHG 模式的 UV 模式可以显示药物的定位位置和形式。图 6 中可以看到无定形灰黄霉素/共聚维酮片剂的多光子 UV 荧光成像。图 6. 无定形灰黄霉素/共聚维酮片剂的紫外双光子激发荧光图像。总结SONICC 提供的极低检测限和选择性使科学家能够更多地了解他们的配方。SONICC 提供了一种分析低载药量配方的方法，否则传统技术无法对其进行研究。SONICC 提供了通过偏光显微镜获得的灵敏度和成像信息，同时仍为 API 提供选择性。我们预想在显着加快的时间点能够进行有意义的评估。用户只能通过 Formulatrix 获得 SONICC 仪器和服务。

如何利用光漂白后的荧光恢复 (FRAP) 来节省用户时间？FRAP 可用于确定某一特定的结晶点样是否具有结晶的可能性。科学家可以在耗时 30 分钟的 FRAP 试验中检查蛋白质构建体、配体、LCP 宿主脂质和沉淀剂。那些表现出蛋白质迁移的结晶条件有可能随后成功结晶。LCP 中的蛋白质扩散 = 结晶的可能性用 FRAP 预筛选配体我们通过高通量 LCP-FRAP 实验评估结晶试验所确定的最佳配体。嘌呤能 P2Y12 与 AZD1283 的受体复合物在 LCP 中的扩散比 ADP 复合物高得多。在对两种复合物进行广泛筛选后，只有 P2Y12-AZD1283 复合物产生了晶体，表明迁移率和结晶产生之间存在很强的相关性。 使用 HT LCP-FRAP 优化血清素受体亚型我们进行高通量 LCP-FRAP 实验以确定结晶试验的最佳血清素 (5-HT) 受体亚型。不同受体亚型的四个代表性结果显示在颜色编码矩阵中，其中蓝色突出显示迁移率几乎为零的结晶板孔，绿色表示中等迁移率，红色表示高迁移率和最高结晶概率。5-HT1Breceptor 是唯一一种在 LCP 中显示迁移并产生用于结构测定的晶体的蛋白质。完全恢复FRAP分析完全恢复 FRAP 分析能够做到探测单孔结晶条件以确定迁移率。FORMULATRIX® 的自动 FRAP 成像仪在 20-30 分钟内以规定的时间间隔测量同一点的荧光恢复。完全恢复曲线提供有关脂质迁移和样品异质性的信息，有助于排除假阳性结晶。具体如何操作在 30 分钟内筛选 96 个结晶条件FRAP 自动分析 96 孔 LCP 板以确定每一滴液滴的迁移率。每个结晶板孔都通过聚焦的激光点进行光漂白，并测量固定时间点后的荧光恢复。在液滴中可迁移的蛋白质百分比表明是否可能产生结晶。FRAP 成像仪发射光漂白激光脉冲，该脉冲从二向色镜反射，通过激发滤光片，从第二个二向色镜反射，漂白样品。LED 通过聚光镜照射光线，光线沿着与激光相同的路径，照射样品。然后处理荧光图像。

无论是用于结构生物学还是一般生物化学需求，蛋白质浓缩和缓冲液交换步骤对于任何制备规模的蛋白质生产都是不可或缺的。这些步骤在纯化实验方案结束时必须至少完成一次，甚至在不同的色谱步骤之间必须至少完成一次，因而这会大大增加实验时间。当前方法超滤是目前浓缩蛋白质的标准，而在实验室规模上，超滤通常涉及一次性离心机驱动设备。这些设备本质上是死角（流动垂直于膜）并在膜处产生浓度梯度。膜处的浓度可能远远超过目标，从而减慢滤液的流动并由于聚集/沉淀而增加材料损失。监测浓缩过程或混合样品的唯一方法是定期中断离心，这让此成为一种相当实用的方法。膜透析是最流行的缓冲液交换方法，而且这种方法与由渗透压驱动的截留分子量膜有关。虽然它是一种无需人工干预的方法，但它需要大量过剩的透析缓冲液、较长的透析时间（8-12 小时）以及随后要进行浓缩步骤。在工业规模上，缓冲液交换和浓缩均通过采用切向流过滤 (TFF) 的单个设备完成。除了滤液渗过膜外，TFF 系统还将有一个与膜平行（或切向）的主动流。这种流实时混合样品（截留物），如果将所需缓冲液添加到渗余物中，则会显着降低浓度梯度并能实现过滤器透析（渗滤）。然而，即使对于死体积为数十到数百毫升的最小 TFF 设备，其也不适合典型的实验室工作流程。µPULSE TFF 系统在这里，我们展示了我们的小型 TFF 系统，它是同类产品中最小的设备之一，专门用于实验室规模的纯化实验。它有着低于 1 毫升的完全可回收死体积，如果进行渗滤，一次可容纳高达 50 mL 的体积，如果仅进行浓缩，则一次最高可容纳 100 mL。与 可容纳 15 mL 的离心设备相比，µPULSE TFF 系统的超滤速度最高可提高 5 倍，并且通过非接触式液体传感完全自动化，能够把截留物体积降至指定的设定值。µPULSE TFF 系统具有一个可消耗的替换盒，该盒包含了一个微流体泵和一个比典型的 15 mL 离心装置稍大的膜（~7.1 cm^2 vs 12.4 cm^2 ），以实现更快的样品浓缩。注意：* 实验使用的是 1 mg/mL BSA** FORMULATRIX® 膜尺寸比 Amicon 大 60%*** 通过用蛋白质溶液填充两个离心管，容纳体积可能达到 100 mL使用 TFF 更快地浓缩样品与使用传统死端过滤的离心机不同,μPULSE 可防止在过滤膜上形成高浓度梯度。这意味着渗透流速没有降低并且样品回收率提高了。使用 TFF,浓缩过程是连续和渐进的,使得样品的浓缩速度比使用死端过滤的离心机快 5 倍以上。与使用传统的死端过滤的离心机相比，µPULSE TFF 系统使用更大的过滤膜（约大 60%）。这种更大的膜具有更高的膜通量,让用户可以更快地浓缩样品,以便继续进行其他研究。简单渗滤（缓冲液交换、脱盐）除了浓缩样品,还可以选择自动渗滤以促进缓沖液交换或脱盐过程。设置简单:系统前端有两个50mL离心管：一管放样品溶液，另一管放缓冲液或其他所需溶液。该系统可以设置为连续渗滤模式或设置为离散渗滤步骤。用户可以通过基于网页的软件应用程序监控渗滤的状态。使用一次性过滤芯片易于维护μPULSE - TFF 系统使用一次性过滤芯片,便于保持系统清洁并防止交叉污染。内置隔膜泵在真空(-10-0 psi)和压力(40-50 psi)之问切换,使溶液在浓缩膜上循环。同时加压芯片和渗滤液体收集罐(15-20 psi) 以帮助强制渗透并加速该过程。提供四种不同浓度的 PES(聚醚砜)膜,截留分子量分别为 10kDa、 30 kDa、 50kDa和100kDa，以覆盖各种蛋白尺寸。可重复使用性和高效能PULSE TFF 的耗材可以多次重复使用，效能几乎没有损失。在标准离心过滤器的浓缩率呈指数衰减的情况下，PULSE TFF 的耗材能够以稳定的速度完成浓缩，只有在达到极高浓度时速度才会减慢。即使在浓缩比截留分子量大 6 倍的蛋白质时，PULSE TFF 耗材的性能也优于标准离心管数倍，在需要重新更换前能轻松浓缩 5-10 倍的溶液。注意：*实验使用的是 1mg/mL BSA (~66kDa)**实验使用的是 1mg/mL 细胞色素 c (~12kDa)

2004 年 Structural Genomics Consortium 的成立显着增加了每年存入蛋白质数据库 (PDB) 的结构数量，原因有两个：大量研究人员专注于解决和存入结构以及创建自动化结晶筛选的空间。如果没有自动成像仪，这是无法实现的，因为结晶实验的常规检查非常耗时。然而，能够分配亚微升体积的专用液体处理器对于加速结晶筛选而言，之前是并且现在仍然是一个硬性需求。这些液体处理器通常被称为自动点晶系统，能让研究人员更快地设置实验，但更重要的是，由于仪器可靠的低体积点样性能，可以使用相同数量的样品设置更多筛选实验。不幸的是，低体积点样的结晶实验对蒸发非常敏感，这可以通过仪器速度（如果仪器没有其他缺点，那么速度就无法提高）或通过添加湿度控制来抵消。主动湿度控制测试我们之前曾说明过湿度控制在结晶筛选中发挥的关键作用（Friedlander 等人，Acta Cryst. (2017). A73, a208）。NT8 将湿度控制提升到一个新的水平，三个独立控制的传感器以线性等比方式响应 NT8 室内的湿度水平。从图表中可以看出，NT8 使用标准设置可以在一分钟内达到设定值，并以最小的波动保持湿度水平。因此，它消除了与大气条件、一年中的不同时间、实验室地理位置等相关的重现性问题。点晶的精度在这里，我们展示了 NT8 的液体处理性能，突显了典型使用场景中出现相对不精确性的次数仅为个位数。NT8 在结晶筛选中使用的典型体积（100 nL 及以上）中表现出低于 3% 的Cv、OA 的固体湿式分配性能。同时，它能够湿式分配小得多的体积（10-50 nL），可用于fragment cocktail/添加剂筛选以及微种晶实验。关于 NT8® 自动点晶系统NT8 是加入点晶仪器的行列最新的自动化解决方案之一。该系统采用模块化头部结构，能够组合搭配低容量 (LV) (=NT8® - 自动点晶系统无需担心加湿导致水用光NT8 在使用少量水的同时保持 85% 的相对湿度。系统还带有上一个 5 加仑的水箱，这意味着用户在点样过程中不会用完加湿量或需要经常补充去离子水。材料和方法NT8 主动加湿控制测试将NT8 放置在一个封闭的房间中一夜， 房间相对湿度平衡在45% 。然后使用两个 Sensiron® SHT31 Smart Gadget 以 1 秒的间隔记录湿度以此收集数据。其中一个 SHT31 设备被放置在 NT8 外面的工作台上，另一个放置在Plate Station 1 中。最后关上 NT8 罩子并在Plate Station 2 上执行简单的结晶板点样，以此模拟典型的操作环境。NT8 小容量点样枪头精度测试精度 (CV) 测试按照“TEMPEST® 液体处理器安装和操作认证”文件中的描述进行，该文件如若需要，可从 FORMULATRIX® 获取。我们进行了三项必要的修改：1) 制作 3110 Au 工作染料以覆盖 20nL 至 200 nL 的范围；2) 制作 6220 Au 工作染料，用于 10 nL 液体点样；3) 使用 Brand® 781602 板替代 Corning® 3631/3632 板简而言之，首先，使用 MANTIS® 连续流量向测试板填充 100 ul 稀释剂。接下来，使用 NT8 将不同体积的荧光素从蛋白质样品区转移到测试板。然后将板转移回 Mantis 以进行第二次 100 ul 稀释剂添加。混合并向下旋转测试板后，使用 BMG Spectrostar Nano® 读板器测量光密度。单个 96 孔板可用于任何给定体积。总体 Cv (Cv, OA) 和每通道 CV 的 RMS (RMS(Cv,1-8) 根据 ISO IWA 15:2015(E) 计算总结根据所提供的数据，我们得出结论，NT8 是结晶筛选的首选工具，它能够通过消除环境湿度以及液滴设定体积性能来完成高度可重复的结晶筛选实验。NT8 的极低容量性能虽然在精度上会欠缺一些，但其仍将有利于微种晶、添加剂和cocktail筛选实验。

F.A.S.T. (Flow Axial Seal Tip) 是一种可靠且易于使用的移液系统，旨在通过其一种正排量的且有着 96 通道的移液机头快速转移任何粘度的液体。F.A.S.T. 凭借其在小体积样品移液方面的高准确度、精确度和可靠性，节省了研究人员的时间并降低了试剂成本。产品特性：快速 - 使用独特的 96通道机头节省用户的移液时间灵活 - 用户可以选择使用 1、8、12 或 96 个吸头在 96 孔板和 384 孔板之间转移试剂，这样节省了消耗品多功能 - 能够轻松进行随意选取、连续稀释和微孔板复制(多板之间复制、母板和子板之间移液)无视液体类别 - 无需再次对试剂液体类别进行编程；正排量吸头可减轻试剂粘度对精度的影响紧凑 - 由于该仪器占用空间小，可放于桌面使用，节省实验室空间，然而其还可与自动化集成互补使用零交叉污染 - 正排量一次性吸头确保样品的完整性，且没有任何交叉污染的风险智能 - 由于系统具有多种最先进的故障保护机制，包括吸头位置传感器、自动吸头排列和碰撞检测，因此用户可以放心地进行移液操作广泛的应用场景DNA 和 RNA 提取 DNA、RNA 和蛋白质纯化 PCR 体系构建和纯化下一代测序 (NGS) 文库制备 筛选库 - 化合物库管理 连续稀释基于细胞的试验抗体试验 酶促试验

为了解决传统死端过滤的离心机使用过程中滤膜堵塞而影响实验效率的痛点，FORMULATRIX 即将推出一款采用切向流过滤技术的生物样品全自动浓缩仪 - µPULSE® - TFF。µPULSE® - TFF 系统是一个全自动、无人值守的系统，它使用切向流过滤 (TFF) 进行样品浓缩和渗滤（缓冲液交换、脱盐）。缓冲液交换产品特性无需用户看守，全自动运行设置所需参数，让系统自动完成剩余工作，直至样本收集完成；用户可通过基于网页的应用程序远程监控设备运行情况。快速完成实验渗透流速比使用常规过滤原理的离心机快2.5倍适用的工作体积范围广µPULSE 可以处理起始体积 为2 到 100 mL的样品 ，比离心浓缩仪或传统TFF 系统适用范围更广更灵活。虽然离心浓缩仪可以处理多个样品，但几乎不能控制浓缩后的最终体积。使用 µPULSE，您可以准确地将浓缩后样品浓度停控在 +/- 0.1 mL之间，最终体积最小能低至 0.5 mL，而且无需测试和稀释。浓缩进度随时可见，可通过手机远程监控溶液全程可观察；无需停下来检查样品节约成本该系统的过滤芯片可重复使用，容纳体积最大至数百毫升（这取决于所使用的样品和截留分子量）便于维护一次性的过滤组件；样品被再循环，然后返回初始离心管

在过去的十年中，人们对开发基于植物和基于细胞的养殖肉类替代品的兴趣日益浓厚[1]。替代的肉类产品被认为更健康、更环保，没有残忍杀害，也更加可持续化。目前这一领域的一个主要限制是一种关键成分的缺乏——脂肪，而脂肪能够提供了与肉类接近的风味、质地和高营养价值。Hoxton Farms (HF)公司开发人工培养脂肪技术来完善肉类替代品，从而改善其味道、质地和营养价值。原代细胞培养物从宿主动物活检建立，然后发展成永生化细胞系。这些细胞在生物反应器中生长，以持续生产脂肪（图 1）。图 1：Hoxton Farms 公司生产细胞培养脂肪的通用实验方案。培养基优化工作流程（绿框）是一个复杂的过程，需要许多液体处理步骤。细胞培养基的开发和优化包括将所有成分微调至最佳浓度，以提高脂肪细胞产量、促进旺盛生长并保持培养脂肪的表型。培养基成分的大量可能组合与能够使用的浓度范围相结合，创造了巨大的组合空间。由于这个过于庞大，因此无法考虑对每个细胞系进行系统采样。为了克服这一限制，Hoxton Farms 公司的科学家们开发了一种模拟脂肪细胞对各种培养基成分的反应的计算机模型。他们采用实验设计 (DoE) 方法来优化有助于测试多因子及其相互作用的生长培养基 [2]。实验次数（独特配方）主要取决于要评估的总因子。覆盖 3 水平 3 因子的典型全因子设计空间需要 27 个实验 (33=27)。DoE 方法将实验次数从 27 次减少到 9 次，但同时仍对每个成分的影响进行评估（图 2）。图 2：3D 区间采样与实验设计 (DoE) 方法之间的比较。DoE 开发了有效的实验设计空间并增加找到稳健的最佳条件的可能性。HF的科学家们在本研究中选择了 24 个因子进行培养基优化。这导致即使在 2 水平上也有广泛的采样空间：224=16,777,216，以及复杂的实验设置，这就需要高通量工作站。虽然 HF 采用的 DoE 方法有助于减少实验次数；然而，执行如此复杂的实验和大量移液操作仍然具有挑战性。MANTIS®介绍MANTIS 是一款精确、多功能、占地面积小的自动化非接触式液体分配器，且有着极低的死体积。它可以在一个实验设置中容纳多达 48 种不同的试剂。每个试剂都与一个独立的微型隔膜泵配对，称为“芯片”（表 1 详细介绍了规格）。此外，LV 和 HV 芯片可以配置有移液器吸头或连接到 15 mL 或 50 mL 管的管道作为输入源。移液器吸头减少了死体积，而管道和试管允许分配大量廉价试剂。芯片可以处理从 1 cP 到 25 cP 粘度的试剂。MANTIS 软件还具有内置的 DoE 数据导入模块。它几乎支持任何格式并接收体积和浓度数据，即时生成分液列表。MANTIS可以选配大容量芯片更换器 (LC3)，其支持多达 28 种不同的试剂，并展示了使用移液器吸头和试管作为输入源。表 1：MANTIS 芯片规格使用 MANTIS 进行 DoE 实验DoE 实验迭代周期包括创建 DoE 设计、使用 MANTIS 制定培养基、培育、数据采集和分析。上一次迭代的结果被输入到下一次迭代中（图 3）。每次迭代从开始到结束大约需要两周时间。图 3：自动化 DoE 工作流程。设计文件通过 Hoxton Farms 的数学模型生成，使用 MANTIS 将复杂的分液步骤在多次迭代中实现自动化。使用 HF 的计算模型开发的 DoE 设计文件直接导入 MANTIS 软件。使用 MANTIS 完成液体处理步骤，将培养基成分在1 μL - 100 μL 体积范围内进行分液。所有培养基成分均通过 LV/HV 芯片进行分液，其中将过滤吸头用作储液器。最后用批量添加的 CF 芯片使培养基达到最终体积。总结HF 已成功将 DoE 应用于培养基配方和细胞系开发，以提高人工培养脂肪产量，使肉类替代品更具吸引力。DoE 在对整个组合空间进行采样的同时大大减少了实验次数。MANTIS 能让用户分配多达 48 种不同的成分并简化 DoE 的操作。MANTIS 非常适合设置 DoE 实验，具有精度高、死体积低、液体类兼容性强及其强大软件的 DoE 导入模块。Hoxton Farms 的研究人员每周节省了大约 60 小时的实验时间，每次实验至少节省了 240 盒 P20/P200 吸头，这使得他们能够在一年内省下一台 MANTIS 的费用。致谢我们要感谢来自 Hoxton Farms 的 Max Jamilly 对开发本应用说明的支持。Hoxton Farms 总部位于英国伦敦，他们培养天然动物脂肪——而不会涉及动物。该公司将细胞生物学和数学模型相结合，为肉类替代品行业生产培养脂肪。

成像仪质量图像质量是购买成像仪以可视化活细胞、生物分子或大分子晶体考虑的最关键的特征之一。作为最终用户，所有人都应该关心的是哪个图像看起来更好，而不是技术细节如何。仅一些的技术细节通常是不够做判别的，并可能导致购买不正确。例如，分辨率为18mpxl的相机比9mpxl的好，但是它真的就意味着前者是更好的相机吗？不能也不应该仅通过一个参数来判断图像的质量。它实际取决于各种因素的组合。准确了解每个规格和技术参数的含义以及它们如何影响图像质量对于平衡和公平的比较是至关重要的。让我们逐一分析并更好地理解它们。像素分辨率相机中所有规格中最常用的参数是分辨率。它由像素定义，像素基本上是构成图像的最小单位。9MPxl的相机包含900万像素。当然，像素数越高，效果越好，因此胜过3MPxl相机。像素的绝对数量很重要，尤其是在要放大图像的情况下。当人们放大图像时，计算机或软件实际上会放大图像并对其进行裁剪（也称为数字缩放），从而降低其分辨率（像素数）。分辨率降低会降低所得图像的图像质量。这就是为什么更高的分辨率是一个优势的原因。但是，像素分辨率是根据相机规格中的像素尺寸除以光学倍率来计算的。例如，一个像素大小为3.5μm的相机与10倍的光学放大倍率配对，将产生3.5 / 10 = 0.35μm的像素分辨率。然而，这并不意味着该系统可以分辨0.35μm的光，因为该系统还将受到光学分辨率的限制，这将在下一段中进行讨论。光学分辨率在显微技术中，分辨率是指成像仪能识别的最小物体的大小。换句话说，就是两个物体之间必须相隔的以使成像仪将对象识别为两个不同的实体最小距离。因为归根结底，研究人员想要的是能够“看到”水滴中最小的晶体。一个分辨率为20mpxl和10μm的成像仪，成像效果无法优于分辨率为9mpxl和0.1μm的成像仪。真正的光学分辨率通常由指定对比度的线对目标的成像测试来确定。每一对线包含一条暗线和一条明线。例如，如果最终成像可以在20%对比度下分辨率为250 lp/mm。光学分辨率则为为1 mm / 250 / 2 = 2um。最终的系统分辨率受光学分辨率和像素分辨率中较高的数值所限制。例如：系统的光学分辨率为2μm，像素分辨率为0.35μm。在目标空间中，可分辨的特征尺寸为2μm。因为集成高像素数字相机通常比设计光学器件容易得多。像素分辨率通常设计为略优于光学分辨率，以便完全捕获光学分辨率。速度时间是最昂贵的商品，毫无疑问，这是对自动成像仪中要求的另一个最重要功能。经测试，ROCK IMAGER 可在3分钟内为的96孔板（1滴/孔）进行每孔5个z坐标切片成像。放大倍数直观来说，最终用户通常将更高的放大倍数与更高的性能联系在一起。如果仅通过光学分辨率来衡量性能，那么这只是部分正确。通常将较高放大率的镜头设计为具有较短的工作距离和较高的数值孔径。光学可分辨特征尺寸的理论极限与NA成反比。因此，高倍率设计可能具有更好的光学分辨率。然而，高倍放大设计也有一些缺点： 1. 为了达到理论光学分辨率，物镜设计将更加复杂和昂贵。在UV的情况下，由于UV玻璃材料的选择有 限，甚至根本不可能达到。2. 较高的放大倍数往往与较短的工作距离有关，因此会限制能够成像的孔板类型。3. 更高的放大率将限制视野（物镜的大小可以被成像）。视场是通过相机传感器的尺寸除以放大倍数计 算出来的。例如，一个带有10mmx 12.5mm传感器，并配有10倍光学放大倍数的相机，其视场将为 1mmx 1.25mm。如果同一台相机配上40倍放大率的光学元件，视场将为0.25 mm x 0.31 mm。由于几乎所有的悬滴、坐滴和LCP液体的直径都大于1毫米，所以0.25mm的视场只能覆盖一小部分液滴。因此，40倍放大的应用在其应用和实用上是极为有限的。

关于 ROCK MAKER®ROCK MAKER是一款功能强大且易于使用的软件程序，可管理从实验设计包括自动图像调度到液体分配、图像查看和评分以及数据分析的整个蛋白质结晶过程。该软件与成像仪和液体处理机无缝集成，以提供完整的自动化解决方案。困难与挑战在过去的十年中，使用自动化和专业软件进行蛋白质结晶已成为学术和工业领域中的普遍做法。结晶自动化和软件方面的进步允许更高的实验通量，增加了确定结构的数量和速率。借助自动化成像系统，研究人员现在可以运行更多实验并制定计划以捕获蛋白质液滴的图像，以了解这些条件随时间的变化情况。此过程的一个瓶颈是手动对这些蛋白质液滴图像进行评分，非常耗时且乏味。图 1. 自动化套件与ROCK Maker 的无缝集成MARCO随着RMv3.15的发布，我们引入了结晶结果机器识别(MARCO)，这是一种著名的可见图像自动评分算法。MARCO以几乎94%的准确率确定可见光路径图像是否包含晶体，从而节省时间并消除对图像评分的猜测。任何由ROCK IMAGER收集的图像将自动被MARCO评分为一个特定图像中存在晶体的概率(0-1之 间)。MARCO是谷歌的几位员工与来自世界各地的多个实验室合作开发的，包括葛兰素史克(美国)、HWI( 美国)、CSIRO(澳大利亚)和百时美施贵宝(美国)。图2. MARCO筛选条件设计，图像收集，自动评分MARCO改进计划与任何机器的学习程序一样，MARCO可以提高其在确定蛋白质液滴图像中晶体存在方面的准确性。在 FORMULATRIX这里，我们正在与来自世界各地的志愿者实验室合作，通过使用直接构建到ROCK MAKER 中的图像提交项目来帮助训练MARCO。为了帮助每个人提高使用MARCO的准确性，用户只需单击一个按钮即可提交他们用于此机器学习培训的拖放图像。除了可见光下自动评分，FORMULATRIX还改进了机器学习算法，以对来自其他光源的图像进行评分，例如紫外线和二次谐波生成（在SONICC中使用）。随着训练图像数量的增加，所有这些类型图像的评分准确性也会增加。

ISO 由位于新罕布什尔州汉诺威达特茅斯学院的麦克莱伦实验室开发（该实验室现已搬迁至德克萨斯州奥斯汀的德克萨斯大学）。关于迭代筛选优化迭代筛选优化(ISO)是一个高度自动化的优化过程，可以帮助研究人员从从最初看起来不太乐观的条件中获得蛋白质晶体。使用由16种独特成分构建的预制筛网，进行初步筛选实验条件。在此实验中收集图像后，用户通过将每个图像评分为透明、结晶、轻沉淀或重沉淀来打分/分类。基于这些分数，ISO 过程创建了一个新实验，其中每个条件下的沉淀剂浓度都会发生变化-增加或减少。例如，如果初始实验得出明确的分数，则下一个ISO实验 将根据溶解度曲线增加沉淀剂浓度。然后在新创建的实验（第2轮）上执行此ISO， 并且此类迭代将在一系列中多进行几次。在第一次迭代后，后续每一轮ISO都会考虑最后两 次实验的分数来计算下一次实验中的沉淀物浓度。ROCK MAKER®结晶软件可以为每个 ISO步骤自动生成实验，根据用户的评分调整每个条件的沉淀浓度。Fig 1. Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit图 2. 使用ISO策略在每次迭代中增加蛋白质晶体命中（红色）的示例。来自McLellan实验室（UT Austin）的数据使用ROCK MAKER®和FORMULATOR®轻松实现ISO使用ROCK MAKER结晶软件和FORMULATOR® Screen Builder筛选，可以快速轻松地将ISO实施到结晶研究中。ISO需使用多种成分，FORMULATOR是唯一能够分配具有多达34种不同成分的复杂ISO筛网的蛋白质结晶液体处理器。简单的ISO工作流程：1. 设置新的结晶实验2. 孵化并根据目测评分3. ROCK MAKER根据分数自动调整每个条件的沉淀浓度4. 使用FORMULATOR Screen Builder分配优化结晶筛选条件5. 每次迭代重复步骤2-4

介绍ROCK MAKER是一款功能强大的软件，用于设计各种结晶实验。该软件已扩展了其功能，可以使用片段和配体轻松创建共结晶实验。该功能对于使用小分子片段进行基于结构的药物发现的研究人员特别有用。现在只需点击几下即可创建这些复杂的实验。片段筛选片段筛选是早期药物发现过程中的一种流行方法，可帮助研究人员识别与靶蛋白活性位点结合的相关小分子。ROCK MAKER为用户提供片段筛选功能，作为一种有组织且整洁的解决方案来保护实验记录。ROCK MAKER中的片段筛选包含可以添加到任何所需实验的单个片段的集合。用户现在可以为共结晶实验添加更多细节，并跟踪某个蛋白质液滴中存在的某个片段。使用ROCK MAKER 中的片段筛选功能，用户可以设计基 于共结晶片段的实验并管理实验数据文档。创建片段筛选在将片段添加到蛋白质样品以进行共结晶之前，用户需要先创建一个片段筛选。这是ROCK MAKER存储所有片段数据以备将来使用的地方。用户可以选择手动将片段数据添加到 ROCK MAKER中，也可以从电子表格编辑器（例如 Microsoft Excel 或 Google Sheets）中复制它们。要从现有电子表格复制数据，只需从电子表格编辑器复制所需的片段，然后将它们粘贴到 ROCK MAKER中即可。需要注意的是，用户必须将数据从 Condition Number表复制到软件内的Notes表中。请参阅下图以供参考。还需要注意的是一旦在实验中使 用片段筛选，它就变得不可编辑，以防止任何可能篡改相关实验的更改。片段筛选选项卡填充片段列表用户可以通过两种方式添加片段：1. 设计共结晶实验时，在蛋白质样品中加入片段。2. 在获得晶体后再加入片段。建议用户在软件的“Experiment Notes”部分注明这是一个浸泡实验。片段筛选非常灵活，用户可以在每孔添加片段层时改变投放位置。用户还可以根据需要编辑片段的体积或工 作浓度。一旦片段筛选条件被保存，它可以作为片段层应用ROCK MAKER的任何实验中。片段层在ROCK MAKER中，片段层定义了一个片段，该片段将被添加到实验的液滴中。用户可以选择在将蛋白质液滴添加到蛋白质层之前或之后添加片段层。ROCK MAKER中的分层系统使用户能够轻松创建复杂的筛选实验，因为用户可以在平板画布上以图形方式勾勒出他们的实验组件应该放在的位置。如右图所示，片段层由蛋白质层顶部的深色阴影以图形方式表示。片段层创建片段层在ROCK MAKER中设计蛋白质结晶实验时，可以将多个片段添加到所需的实验中。创建片段层涉及指定目标孔滴和选择片段筛选条件。只需在孔板画布上选择片段筛选应用到的孔，然后选择所需的片段即可完成此操作。可以添加多个片段层来创建所需的实验。这是设计复杂片段筛选的一种快速简便的方法，同时将所有实验数据保存在一个地方。选择所需的孔以添加片段层

蒸汽扩散现仍是用于生长蛋白质晶体以进行X射线衍射的最常用技术。在这种方法中，将蛋白质溶液与储液混合，将这种混合物的小体积液滴与体积较大的储液平衡。液滴溶液具有较低的溶质浓度，与储液溶液相比具有较高的蒸汽压，这导致水随着时间的推移从液滴扩散到储液溶液，直到两者达到平衡。液滴的水分蒸发导致蛋白质和沉淀剂浓度的增加，使蛋白质通过亚稳相进入晶体成核相。平衡速率取决于几个因素：所使用的沉淀剂的类型和浓度、温度、湿度、液滴和储液器之间的距离、以及液滴：储层体积比2。在结晶板的设置过程中，液滴的蒸发会导致液滴与储层体积比的不良变化。对于给定的储层体积，较小的液滴平衡更快，在有利于晶体形成的条件下，可能会引发过度成核，从而导致更小的晶体尺寸。由于局部蛋白质或沉淀剂浓度高，大量的水蒸发可能导致蛋白质变性，形成盐晶体（例如硫酸铵晶体），液滴表面形成皮肤，或液滴干燥。直接影响水滴蒸发速率的因素是相对湿度（RH）。高RH在设置结晶板，可以减缓蒸发过程。结晶板放置的房间里的RH通常没有严格的规定，而且会随着季节的变化而变化。这可能会导致结晶试验结果的差异，从而对实验的可重复性产生负面影响，这是目前科学界面临的一个主要问题。在蛋白质晶体学中使用机器人来处理液体，提高了液滴分配的准确性，并加快了结晶板的制备速度，以避免大量的水滴蒸发。然而，即使提高了液滴分配的速度和准确性，平均仍需要2-10分钟才能完成每液滴1-3 滴的96-孔板的制备。一些结晶机器人，包括富默乐的NT8移液工作站，可以在制版过程中精确控制湿度，显著减少液滴蒸发。湿度通过限制需要优化的变量控制，提高了可重复性，因此实验结果不再依赖于结晶板上的分液位置、时间准备，或者制备时所处的季节，而主要受成分浓度和体积的影响。在本应用手册中，我们评估了湿度对结晶板制备过程中液滴大小和组成的影响。实验设置为了测试不同沉淀剂对液滴蒸发速率的影响，我们选择了三种溶液:1. 0.5 mM荧光素，10% DMSO, 100 mM Hepes pH 7.52. 0.5 mM荧光素，10% DMSO, 100 mM Hepes pH 7.5, 20% PEG 10K3. 0.5 mM荧光素，10% DMSO, 100 mM Hepes pH 7.5, 1.6 M硫酸铵它们在这里分别称为缓冲液、聚乙二醇和硫酸铵。使用富默乐的NT8滴定仪在结晶板上分液。在LCP夹层板(Hampton HR3-1510)上分配200 nL和1μL体积的液滴。目的是研究在10分钟内液滴蒸发的情况，这是滴落器准备96-孔板（每孔3滴）所需的平均时间。为了达到这个时间范围，在每列分液之后，机器人需要等待40秒钟才能继续分配。之所以选择LCP板，是因为夹层的组装可以防止快速滴蒸发，从而在液滴体积明显损失之前有时间对板进行成像。此外，液滴被压下，液滴的厚度是均匀的。因此，液滴面积可以用来估计从不同的孔板和有不同的成分液滴之间的体积变化。否 则，就必须考虑液滴的形状，包括水滴的不同厚度。用来自富默乐的FRAP成象仪在荧光素激发和发射波长分别为485nm和524 nm的荧光模式下对孔板进行成 像。不同孔板的曝光时间不同。根据孔容量的不同，液滴成像时间为400-2000 ms，以获得液滴与孔底之间的高对比度。将增值设置为1。每个液滴在15个聚焦层上成像，并将所有图像合并为一个扩展聚焦图像，用于计算液滴的表面积。来自荧光素的强烈荧光信号可以方便和精确地定位液滴位置。使用ImageJ软件测量液滴大小。对于每一滴水（每孔板96滴），液滴图像被转换为8位灰度。想测量的对象的强度阈值设置为40-255范围。计算大于1000px的颗粒的粒径，每个孔仅需进行一次测量即可反映出液滴的大小。对于每个时间点，设置8个独立的液滴，测量每个液滴的表面积，并基于这些测量结果计算平均液滴大小。实验误差计算为获得值的标准偏差。液滴大小与液滴平均大小相差50%以上的液滴被排除在最终计算之外（1728次测量中有25次）。液滴的体积损失表示为平均液滴面积除以最后分配在孔板上的液滴面积（参考液滴）的百分比。结论在有和没有湿度控制的情况下设置的液滴蒸发速率。在设置为环境RH或85％RH（由NT8湿度控制室确保）的控制上，随时间监测结晶液滴的大小。在环境相对湿度下，开始制备孔板后的1.8分钟内，对于所有测试条件，200 nL的25％的滴液和1μL的15％滴液已蒸发（图1）。2.7分钟后，大概是分配一个每孔1滴的96-孔板所需的时间，对于200 nL液滴，蒸发了29％ 的PEG，32％的硫酸铵和39％的缓冲液条件（表1）。1μL时的液滴损失略低，在18％至25％之间变化。6.3分钟后，在200 nL /1μL液滴中，PEG的液滴损失增加至42/41％，硫酸铵的液滴损失增加至52/43％，缓冲液的液滴损失增加至55/48％。将相对湿度从环境RH（50％）增加到85％RH会显着降低液滴的蒸发速率（图1）。在85％的相对湿度下 2.7分钟后，在任何条件下（0-3％，这均在实验误差范围内），液滴尺寸均无明显下降。6.3分钟后，对于200 nL液滴，液滴大小减小0-10％，对于1μL液滴，液滴大小减小2-7％，与环境RH中的液滴损失相比，下降了约5倍。在此实验装置中，溶液类型与蒸发速率之间没有显着相关性。图1. 对于3种不同的溶液，在2个RH设置（环境RH为50%和RH设置为85%）中，在10分钟过程中剩余的200 nL(上)和1μL(下)滴度的百分比。误差条表示实验重复8次后液滴面积的标准差。表1. 在2.7分钟和6.3分钟时，液滴蒸发与参考液滴相比的百分比。2. RH为95％的液滴大小我们还评估了在95％的湿度下随时间流逝的液滴损失。在这种湿度设置下，孔板上会覆盖薄雾，这可能会造成液滴吸收水分而导致液滴尺寸增加。但是，在95％的湿度下，1μL液滴的液滴大小没有明显增加。相反，在200 nL液滴中，有40％的液滴大小与参考液滴相比增加了5％以上。对于在95％RH条件下 在板上停留超过9.0分钟的液滴，观察到PEG和缓冲液200 nL液滴的大小增加，而对于硫酸铵，是在3.6分钟后观察到液滴大小增加。3. 在夹层组装之前，为PEG和硫酸铵干燥的液滴百分比在室温下的某些条件下，在制备孔板的过程中，选定的液滴会变干。在200 nL PEG条件下，一些液滴在 2.7分钟后变干（表1）。6分钟后，最初的1μL液滴变干 4.5分钟后，硫酸铵滴200 nL和1μL开始干燥。缓冲液滴的大小有所减小，但在10分钟的实验过程中并未完全变干。总之，在孔板制备的10分钟后，平均38％的PEG液滴和58％的硫酸铵液滴被完全干燥（图2）。此外，在制板5分钟后，硫酸铵晶体开始在200 nL 液滴中出现（图3）。相反，在将RH设置为85％的受控RH环境中设置的任何条件下，滴液都不会变干，也不会形成盐晶。图2. A)环境RH为50%，B)孔板制备10分钟后，相对湿度为85%。从左到右依次为200nl，1μL硫酸铵条件，200nl, 1μL PEG条件。图 3. 结晶板制备 5分钟后硫酸铵晶体的形成。结论本文中，我们研究了RH对制版过程中结晶液滴蒸发的影响。在2.7分钟后，在环境RH中设置的200 nL和1μL 液滴平均损失了32％和22％的体积，而在85％RH条件下，没有观察到液滴体积的损失。值得注意的是，市售移液器制备96-孔板每孔1滴所需的平均时间为2-3 分钟。当在室温RH条件下蒸发49％的200 nL液滴和44％的1μL液滴后，这种液滴大小差异在6.3分钟后变得更加明显。然而在85% RH下，200 nl的液滴只有7%蒸发，1μL的液滴只有5.3%蒸发。液滴损失的这种显著减少大大影响了液滴中溶质的浓度，这影响了液滴蒸发的速度，在极端情况下可能导致蛋白质变性。在这种情况下，无法获得结晶并不是原始条件不适合结晶形成的结果，也不能准确地代表筛选出的结晶空间来选择好的结晶条件。但是，可以通过使用高于环境湿度的RH来避免此问题，正如我们已展示的那样，RH可以减少液滴的蒸发。湿度控制室是富默乐 NT8移液器的一部分，使用户可以在制版过程中精确控制湿度水平。

蛋白质结晶成像生物晶体明确且可靠的鉴定仍然是晶体学研究的一个主要障碍，特别是在实验初步筛选的关键阶段。在可见范围内的高分辨率自动成像往往不足以识别所有产生或可能产生晶体的条件。晶体学家经常依靠芳香族氨基酸的固有荧光，如色氨酸，来区分盐晶和蛋白质晶体。紫外荧光成像检测色氨酸的荧光，并在许多情况下产生高对比度的图像，有助于表征结晶液滴。在某些情况下，蛋白质含有很少的色氨酸氨基酸，或者根本没有，无法使用紫外荧光成像。在蛋白质中添加荧光分子，可以在很短的成像时间内获得高对比度的图像，且样品没有损伤。蛋白质的染料标记有许多方法标记蛋白质与荧光染料，范围从非常简单没有纯化步骤的实验方案，到利用利用色谱柱去除多余的染料等涉及更多步骤的方法。一种简单的方法是将琥珀酰亚胺酯染料在DMSO中溶解，然后将其直接添加到自己的蛋白质溶液中，等待5分钟，然后照常分配蛋白质。Formulatrix成像仪在检测荧光时非常灵敏，因此只需要标记0.1%的总蛋白即可。在向蛋白质中添加染料时，重要的是要使用不包含竞争性反应性胺且pH值为7至8的缓冲液。据观察，在等待 5分钟后，当标记率低于所有赖氨酸的1%时，超过80%的染料已经被标记到蛋白质上，这使得从溶液中去除多余的染料不是必要的。比率大于1％的标记将导致反应性酯的不完全水解，并导致溶液中过量的未结合染料在成像时产生强烈的荧光背景。0.1％至0.3％的标记足以用Formulatrix成像仪生成高对比度图像。标记率的提高只会降低图像质量和/或需要纯化以去除过量的染料。当pH值非常低或非常高时，会极大影响标记效率，导致标记完全失败。当pH值约为6.5可能会导致蛋白质氨基末端的选择性标记。最佳的pH值范围在7.0至8.4 之间，这将有助于达到预期的结果。通常来说，利用小分子修饰蛋白质的想法是会令人不安的，会引起是否对结晶和构象产生负面影响的担忧。这里描述的方案和例子是0.1%的可用赖氨酸被标记的蛋白质，结果对其余99.9%的蛋白质影响很小。话虽如此，这也不是一个完全受控的过程，可以想象标记蛋白的构象会受到不同染料附着位置的影响。值得注意的是，这是赖氨酸与染料结合的一个相对随机的过程，其构象会发生变化，但与99.9%未标记的蛋白质相比，仍在统计学上并不相关。晶体学是一种平均技术，其最终结构是晶体中每个分子的平均。因此，0.1%蛋白质的异常将被平均掉，而不会影响最终的整体晶体结构。此外，衍射质量的晶体是由非常均匀的蛋白质分子组成的。这意味着，如果标记影响了蛋白质的结构/构象，被标记的蛋白质将不会率先进入晶体。反之亦然，如果标记的蛋白质最终处于衍射晶体中，其构象将与未标记的蛋白质几乎相同，而不会对晶体结构产生不利影响。这是预期的结果，也是该技术所依赖的。多荧光成像Formulatrix成像仪提供了对三种不同波长的结晶板进行自动成像的功能。这使得科学家可以利用紫外通道和其他两种可见光波段的固有荧光。光学器件设计用于紫外和可见荧光成像，每个通道都有单独的光源，以提高灵敏度。当对结晶板成像时，滤镜立方体会自动切换，并且可以完全自定义使用目标染料（图1）。图1. 具有3个完全可定制的滤光器模块自动切换的多 荧光光学路径。蛋白质-蛋白质复合物检测通过多荧光成像得以简化。一个人操作就可以简单地用不同的荧光团标记每个蛋白质，图像上都有可见的荧光通道，只要发现荧光重叠，就可以知道这两种蛋白质都存在于晶体中（图2）。图2. 蛋白A-蛋白B复合物晶体，其中蛋白A标记为texas red，蛋白B标记为荧光素。荧光染料的选择和影响可以根据所使用的蛋白质、pH值范围和成本来选择染料。同样重要的是，确保如果使用两个不同的染料有最小光谱重叠。通常来说，所有的N-羟基琥珀酰亚胺酯缀合染料在水溶性条件下都是有效的标记。荧光素和texas red是两种便宜的染料，在光谱上是分离的，并能产生良好的结果。然而，它们确实表现出了对pH依赖性，荧光素对pH小于7.0特别敏感，pKa为6.4（图3），因此在各种蛋白酶抑制剂Cocktail的条件下筛选并不理想。Alexa 488和Alexa 594是两种光谱分离染料的好选择，在各种条件下都能很好地工作， 并且在pH4和10之间没有pH依赖性。图3.荧光素的pH依赖性光谱：A）吸收光谱，B）发射光谱。膜蛋白的标记膜蛋白的标记不像可溶性蛋白那么容易。对于膜蛋白来说，可能无法获得大量的赖氨酸残基，这使得难以确定要添加的正确染料量。而且，大多数荧光染料包含高度疏水的芳族环，该芳族环通过与带电基团连接而变得水溶性。因此，许多染料会分解成疏水性去污剂微团或微细胞，导致溶液中的有效浓度发生变化，未反应染料的浓度变高。Cherezov在他的FRAP 分析方法论文中解释了一个标记膜蛋白的有用例子。用可见荧光屏蔽使用荧光染料提高了灵敏度，因此在筛选时更容易找到晶体。例如，与周围的沉淀物相比，由于小晶体中蛋白质的浓度较高，因此可以区分掩埋在沉淀物下的小晶体（图4）。使用高倍物镜也可以看到高分辨率小晶体。大范围的变焦值允许液滴自动定位，然后以更高的稳定性成像。还可以以更高的分辨率查询自定义的感兴趣区域，以产生更精细的细节和对比度（图5）。图4.小的蛋白质晶体在可见的荧光图像中可视化，否则在传统的明场图像中将看不到。图5. Formulatrix成像仪中的大视野范围使液滴可以自动成像，并且可以定义感兴趣的自定义区域以产生更高分辨率的图像。结论多种成像技术可用于筛选蛋白质结晶板，包括可见光、双折射光、紫外荧光和可见荧光成像。用小分子荧光团标记很小百分比的蛋白质的能力使人们可以检测高蛋白质浓度的区域。染料标记的蛋白质发出的荧光可以很容易地区分蛋白质和盐晶，也可以找到隐藏在沉淀物下的小晶体。当处理蛋白质-蛋白质复合物时，它也是一个很好的工具。人们可以简单地使用不同染料标记每个蛋白质，然后成像，以查看它们在哪里发现荧光的共定位。这样就可以确定晶体是否同时包含两种蛋白质，且无需进行XRD表征。0.1％的标记率对晶体质量和蛋白质结构输出几乎没有影响，使其成为一种非侵入性方法。0.1%标记示例-溶菌酶1. 在DMSO中溶解染料，形成5mM的原液2. 用溶菌酶的MW常数为14.7kDa (147000 g/ mol)，可以将20 mg/ml溶菌酶溶液转化为1.36 mM3. 假设对氨基残基的标记效率为1:1，并利用溶菌酶有6个赖氨酸，100%标记所有活性位点等于8.16 mM4. 如果只需要标记0.1%的位点，则染料的添加浓度应为8.16μM5. 在250μL的20mg/ml溶菌酶溶液中加入0.4μL 5mM染料，蛋白标记率为0.1%

将MANTIS®液体处理器集成到一个新的工作流程中，用于分析单细胞的全长转录组，使实验小型化单细胞RNA测序(scRNA-seq)是一种用于研究单个细胞转录谱的技术。与传统的大群体测序不同，它强调了mRNA水平的细胞-细胞变异，更深入地了解健康和疾病的先决条件。scRNAseq的主要挑战来自于单个细胞只包含少量的mRNA。从极其有限的材料中提取有意义的生物信息需要具有特殊灵敏度和重现性的scRNA-seq制备方法。为了解决这一需求，Takara Bio的研究人员开发了SMART-Seq®单细胞试剂盒(SSsc)。SSsc通过直接从单个细胞中生成高质量的全长cDNA，仅用2pg的RNA就能提供敏感且高重复性的结果。最近，通过将FORMULATRIX®旗下MANTIS®液体处理器集成到SSsc工作流程中，可以在不影响产量、灵敏度、重复性的情况下将反应体积缩小到原来的四分之一，进一步增强了这种强大的新一代测序技术的实用性。SMART-Seq®单细胞试剂盒技术的几个优点与现有的用于制备scRNA-seq样品的技术相比，SSsc有几个优点。这包括优越的灵敏度和重复性；一个简单的、模板化的工作流；以及不受小型化影响的强劲性能。考虑到SSsc的灵敏性和重复性，Takara的研究人员已经证明SSsc比广泛使用的Smart-seq2技术检测到更多的淋巴母细胞系 (GM12878)基因，同时斯皮尔曼相关性系数显示SSsc具有更高的重复性( 图 1 ) 。在此对比分析 中，SSsc方法具有良好的精度，没有缺失值，在384个Cq值的标准偏差为 0.133，在0.5个周期内，99.5%的数据点都落在半圆内。这种性能尤其对RNA含量极低的细胞进行测序拥有极高的价值，它可以用来识别罕见的基因或检测单核苷酸多态性(SNPs)。图1:SMART-Seq®单细胞试剂盒优于Smart-seq2。采用SSsc(18个细胞)或Smartseq2 (20个细胞; Picelli et al. 20141) 对淋巴母细胞系(GM12878)基因的gle细胞进行19个周期的PCR处理。如上所述，生成RNA-seq库，将所有样本标准化至175万双端reads后，分析se-quences。图a是在处理SSsc的细胞中检测到的更多基因。图B相关箱形图显示SSsc处理的细胞之间具有更高的斯皮尔曼相关性，这表明与Smartseq2相比具有更高的重复性。一个简单的、模板化的工作流SMART-Seq®单细胞试剂盒采用了一个简单的、模板化的工作流程，包括将细胞分配到预先准备的孔板上，反向转录RNA，然后通过PCR扩增得到的cDNA；然后在定量或者库准备之前对其进行纯化。图2总结了原始的、完整工作流程，橙色标记出了转移到MANTIS液体处理器上完成的步骤。图2：SSsc工作流。使用MANTIS®液体处理器进行的步骤以橙色显示。使用MANTIS®液体处理器，实现了稳健实验的小型化通过将MANTIS®液体处理器引入SSsc工作流程，Takara的研究人员已经能够自动化三个关键的步骤：孔板制备、添加RT master mix、添加PCR master mix，如图2所示。这不仅提高了工作流效率，而且还使SSsc工艺能够转移到384孔板上，从而使反应体积减少到四分之一，获得更高、更有价值的灵敏度。图3:MANTIS®显示移液管尖端通过小管连接到高容量(HV)芯片上。使用MANTIS液体处理器运行的全体积 和四分之一体积SSsc工作流的性能类如 图4所示。在这两种情况下，每个细胞大约产生60-80 ng的cDNA，鉴定出的基因数量相似。从图5中可以看出，降低整体体积并没有降低灵敏度或重复性，强调了SSsc与小型化的兼容性。四份已经详细制定的实验方案，规定了在MANTIS液体处理器上执行SSsc配件的分步工作流程，描述了96孔板中的全体积、半体积和四分之一体积反应大小，以及384孔板中的四分之一体积反应大小。这些实验方案可从FORMULATRIX网站下载。图4:使用MANTIS®液体处理器进行全体积和四分之一体积移液的工作流程的相似产量和灵敏度。图5:组内Pearson(图A)或Spearman(图B)在全体积或四分之一体积下处理的所有细胞之间的相关性表明，重复性和灵敏度不会因体积减少而受到影响。SMART-Seq®单细胞试剂盒为进行全长转录组分析提供了许多好处，这种有价值的新一代测序技术的范围可以通过集成MANTIS液体处理器到SSsc工作流程，进一步扩展。通过将SSsc的灵敏度和重复性与MANTIS液体处理器提供的样品处理效率、更小的反应体积相结合，研究人员可以实现对珍贵样品材料越来越详细的表征。可以从FORMULATRIX网站的参考资料页面下载使用Smart-Seq®单细胞试剂盒在MANTIS液体处理器上的全体积、半体积、四分之一体积和384-孔板四分之一体积的详细实验步骤。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一项突破性技术，极大地提高了研究生物系统的分辨率。现在可以将复杂的组织分解成它们各自的细胞类型，并了解它们的基因表达模式。此外，现在不仅可以表征细胞群之间的异质性，而且可以表征细胞内的异质性，通常这会对定义细胞类型的概念提出挑战。scRNA-seq技术已迅速成熟，但经常是封闭的商业系统或需要专门的设备。最近， 瑞典Karolinska研究所的HagemannJensen博士及其同事报告了Smart-seq3技术的开发，这使得通用的Smart-seq化学方法更新迭代。与Smart-seq2相比，Smart-seq3的灵敏度大大提高，通常每个细胞可检测数千个基因。此外，该协议现在实现了涵盖全长度记录副本和5’UMI标记的独特混合方法。这样既可以进行精确的定量mRNA测量，又可以保留覆盖全长度的独特能力，以研究其他剪接异构体和表达遗传变异。实际上，Smart-seq3库可以通过相对便宜的试剂成本生成，且不需要特定于平台的设备。然而，通过集成Formulatrix的MANTIS®液体处理器（图1），可以自动执行Smart-seq3协议的大多数操作步骤，以提高通量，减少死体积并减少移液步骤，降低移液器吸头成本。图 1: MANTIS液体处理器在本应用指南中，我们将演示在库准备工作流程中，使用MANTIS的关键步骤。Smart-seq3是一种独特的全长度定量scRNA -seq协议。Smart-seq3利用既定的96孔及384孔微孔板块进行库准备。首先，单细胞需要被分离并放置到含有裂解缓冲液的孔中。通常情况下，将通过FACS技术进行筛选，大多数实验室都可以通过其核心设备来实现，也可以通过显微解剖或激光捕获。直到进一步处理前，裂解板可以-80°C保存。首先，mRNA将被反向转录，第一链cDNA模板与含有umi的5 ‘寡核苷酸(TSO)进行交换。然后，用PCR进行全长cDNA扩增，扩增后的cDNA用磁珠纯化。通过这种纯化，使用荧光DNA结合染料对cDNA进行定量，以便准确地使整个板上的cDNA浓度标准化。标准化cDNA的一部分，采用标记法和PCR法，进行库准备工作。在汇集所有索引库DNA后，可以在任何传统的Illumina平台上执行测序。Smart-seq3协议是完全开源的，所有深入步骤和试剂数量都已存储在协议中。使用MANTIS低容量(LV)和高容量(HV)芯片有效分配试剂单细胞RNA-seq库制备的关键目标是在扩增前避免mRNA分子丢失。从理论上讲，损失可能发生，核酸可能被吸附在实验室通用塑料的表面，如移液管吸头。利用MANTIS的非接触分配，消除手动液体处理步骤，从而避免了这个潜在的问题。此外，快速分配速度最大限度地减少了逆转录之前所花费的时间，甚至可以将保持板与兼容冷块结合，获得最佳的样本温度。另一方面，非接触式分配也减少了吸头的支出，每384孔板的用量相当可观。此 外，MANTIS低容量(LV)和高容量(HV)芯片的低死体积节省了宝贵的试剂用量 (图2)。图2：凭借MANTIS的低死体积，及用移液管吸头直接装载试剂和，保证了最少的试剂浪费，例如分配逆转录母料混合物。使用MANTIS持续流量（CF)，易于测量浓度和标准化。在成功生成预扩增的cDNA库后(图3)，Smart-seq3的研究人员运用可选步骤，在浓度标准化后确定所有扩增库的DNA浓度。图3:在安捷伦生物分析仪上运行的一个成功的Smart-seq3 cDNA库的例子。在最终库准备步骤时输入相同的DNA浓度，确保了更好的下游均匀性和序列质量。通过利用MANTIS 的持续流量功能，将大量染色的荧光DNA溶液分配 至适合荧光强度测量的黑色微孔板。在获得并计算出每孔中的cDNA浓度之后，创建Excel或 OpenOffice电子表格计算出所需要的不同水量，将cDNA调整到设定的浓度。这一步骤可以在已经装有预扩增库的孔板上完成，也可以使用新的孔板。MANTIS的另一个独特之处在于，可以直接导入包含整个孔板的体积分配值的电子表格(图4)。MANTIS软件允许实时计算和自动创 建分配列表，包括根据直接从微波微流控孔板读取器的输出中导入并标准化的浓度测量。这 使得不同的体积液体可以被快速且准确地分配到每一个384孔板中。CF或HV芯片都可以用来 分配这些不同的体积。图4:标准化cDNA浓度的分配布局，可以通过电子表格计算将需要分配的不同水量导入MANTIS软件，也可以使用内置的标准化向导程序直接导入孔板读取器的输出值。可负担得起的测序库为了创建测序准备库，Smart-seq3依赖转位子Tn5将预扩增的cDNA切成更小的片段。在酶裂解过程中，Tn5酶将预先装载的寡糖插入切割位点，从而实现双索引PCR。考虑到在该方法中应用的反应体积的稳健小型化，使用MANTIS分配试剂及标记反应及后续PCR所需的酶。这大大降低了变异性，也降低了Tn5酶绝对反应的成本。总的来说，在scRNA-seq工作流程中使用MANTIS，大大减少了所需的塑料喷嘴损耗数量。从开始到结束，减少至少8盒384孔移液喷嘴使用量，通常会为用户节省250至400欧元。此外，MANTIS将工作体积、成本显著降低到每个细胞0.5-1.0欧元。使用Smart-seq3进行高质量的转录组测量在完成库准备工作流程后，Smart-seq3兼容任何通用 Illumina测序平台。卡罗林斯卡研究所的研究人员通过 HEK293T细胞实验，证明了他们的单细胞RNA测序方法的高质量。在平均测序深度为180万reads的下，质量数据现实，大部分的基因读长证明了人类参考基因组的外显子和内含子区域，与成熟和新生的mRNA存在一致( 图5)。此外，库的准备工作对检测RNA分子表现出极高的敏感性，从而检测到大量基因。图5：典型的Smart-seq3实验质量统计。在384 孔板中对HEK293T细胞进行解码，平均测序深度为每个细胞180万reads。卡罗林斯卡学院的研究人员表明，在工作流程中使用 MANTIS，用Smart-seq3从单细胞中创建测序库，是一种获得高质量、高通量、高重复性的好方法，同时又减少人工劳动、塑料品消耗和总成本。此外，MANTIS技术展示了应用于其他现有的单细胞RNA测序方法的潜力及多功能性，并有助于开发新的研究方法。致谢富默乐要感谢Christoph Ziegenhein和Michael Hagemann- Jensen以及Karolinska研究所的同事，感谢他们在评估MANTIS分液技术在Smart-seq3 流程中运用的做出的贡献，以及在此应用说明中提供的证明结果。