使用MANTIS®自动移液工作站，通过Smart-seq3生成高质量的单细胞RNA-seq数据

单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一项突破性技术，极大地提高了研究生物系统的分辨率。现在可以将复杂的组织分解成它们各自的细胞类型，并了解它们的基因表达模式。此外，现在不仅可以表征细胞群之间的异质性，而且可以表征细胞内的异质性，通常这会对定义细胞类型的概念提出挑战。scRNA-seq技术已迅速成熟，但经常是封闭的商业系统或需要专门的设备。最近， 瑞典Karolinska研究所的HagemannJensen博士及其同事报告了Smart-seq3技术的开发，这使得通用的Smart-seq化学方法更新迭代。

与Smart-seq2相比，Smart-seq3的灵敏度大大提高，通常每个细胞可检测数千个基因。此外，该协议现在实现了涵盖全长度记录副本和5’UMI标记的独特混合方法。这样既可以进行精确的定量mRNA测量，又可以保留覆盖全长度的独特能力，以研究其他剪接异构体和表达遗传变异。

实际上，Smart-seq3库可以通过相对便宜的试剂成本生成，且不需要特定于平台的设备。然而，通过集成Formulatrix的MANTIS®液体处理器（图1），可以自动执行Smart-seq3协议的大多数操作步骤，以提高通量，减少死体积并减少移液步骤，降低移液器吸头成本。

图 1: MANTIS液体处理器

在本应用指南中，我们将演示在库准备工作流程中，使用MANTIS的关键步骤。

Smart-seq3是一种独特的全长度定量scRNA -seq协议。

Smart-seq3利用既定的96孔及384孔微孔板块进行库准备。首先，单细胞需要被分离并放置到含有裂解缓冲液的孔中。

通常情况下，将通过FACS技术进行筛选，大多数实验室都可以通过其核心设备来实现，也可以通过显微解剖或激光捕获。直到进一步处理前，裂解板可以-80°C保存。首先，mRNA将被反向转录，第一链cDNA模板与含有umi的5 ‘寡核苷酸(TSO)进行交换。然后，用PCR进行全长cDNA扩增，扩增后的cDNA用磁珠纯化。通过这种纯化，使用荧光DNA结合染料对cDNA进行定量，以便准确地使整个板上的cDNA浓度标准化。标准化cDNA的一部分，采用标记法和PCR法，进行库准备工作。在汇集所有索引库DNA后，可以在任何传统的Illumina平台上执行测序。

Smart-seq3协议是完全开源的，所有深入步骤和试剂数量都已存储在协议中。

使用MANTIS低容量(LV)和高容量(HV)芯片有效分配试剂

单细胞RNA-seq库制备的关键目标是在扩增前避免mRNA分子丢失。从理论上讲，损失可能发生，核酸可能被吸附在实验室通用塑料的表面，如移液管吸头。利用MANTIS的非接触分配，消除手动液体处理步骤，从而避免了这个潜在的问题。此外，快速分配速度最大限度地减少了逆转录之前所花费的时间，甚至可以将保持板与兼容冷块结合，获得最佳的样本温度。另一方面，非接触式分配也减少了吸头的支出，每384孔板的用量相当可观。此 外，MANTIS低容量(LV)和高容量(HV)芯片的低死体积节省了宝贵的试剂用量 (图2)。

图2：凭借MANTIS的低死体积，及用移液管吸头直接装载试剂和，保证了最少的试剂浪费，例如分配逆转录母料混合物。

使用MANTIS持续流量（CF)，易于测量浓度和标准化。

在成功生成预扩增的cDNA库后(图3)，Smart-seq3的研究人员运用可选步骤，在浓度标准化后确定所有扩增库的DNA浓度。

图3:在安捷伦生物分析仪上运行的一个成功的Smart-seq3 cDNA库的例子。

在最终库准备步骤时输入相同的DNA浓度，确保了更好的下游均匀性和序列质量。通过利用MANTIS 的持续流量功能，将大量染色的荧光DNA溶液分配 至适合荧光强度测量的黑色微孔板。在获得并计算出每孔中的cDNA浓度之后，创建Excel或 OpenOffice电子表格计算出所需要的不同水量，将cDNA调整到设定的浓度。这一步骤可以在已经装有预扩增库的孔板上完成，也可以使用新的孔板。MANTIS的另一个独特之处在于，可以直接导入包含整个孔板的体积分配值的电子表格(图4)。MANTIS软件允许实时计算和自动创 建分配列表，包括根据直接从微波微流控孔板读取器的输出中导入并标准化的浓度测量。这 使得不同的体积液体可以被快速且准确地分配到每一个384孔板中。CF或HV芯片都可以用来 分配这些不同的体积。

图4:标准化cDNA浓度的分配布局，可以通过电子表格计算将需要分配的不同水量导入MANTIS软件，也可以使用内置的标准化向导程序直接导入孔板读取器的输出值。

可负担得起的测序库

为了创建测序准备库，Smart-seq3依赖转位子Tn5将预扩增的cDNA切成更小的片段。在酶裂解过程中，Tn5酶将预先装载的寡糖插入切割位点，从而实现双索引PCR。考虑到在该方法中应用的反应体积的稳健小型化，使用MANTIS分配试剂及标记反应及后续PCR所需的酶。这大大降低了变异性，也降低了Tn5酶绝对反应的成本。

总的来说，在scRNA-seq工作流程中使用MANTIS，大大减少了所需的塑料喷嘴损耗数量。从开始到结束，减少至少8盒384孔移液喷嘴使用量，通常会为用户节省250至400欧元。此外，MANTIS将工作体积、成本显著降低到每个细胞0.5-1.0欧元。

使用Smart-seq3进行高质量的转录组测量

在完成库准备工作流程后，Smart-seq3兼容任何通用 Illumina测序平台。卡罗林斯卡研究所的研究人员通过 HEK293T细胞实验，证明了他们的单细胞RNA测序方法的高质量。在平均测序深度为180万reads的下，质量数据现实，大部分的基因读长证明了人类参考基因组的外显子和内含子区域，与成熟和新生的mRNA存在一致( 图5)。此外，库的准备工作对检测RNA分子表现出极高的敏感性，从而检测到大量基因。

图5：典型的Smart-seq3实验质量统计。在384 孔板中对HEK293T细胞进行解码，平均测序深度为每个细胞180万reads。

卡罗林斯卡学院的研究人员表明，在工作流程中使用 MANTIS，用Smart-seq3从单细胞中创建测序库，是一种获得高质量、高通量、高重复性的好方法，同时又减少人工劳动、塑料品消耗和总成本。此外，MANTIS技术展示了应用于其他现有的单细胞RNA测序方法的潜力及多功能性，并有助于开发新的研究方法。

致谢

富默乐要感谢Christoph Ziegenhein和Michael Hagemann- Jensen以及Karolinska研究所的同事，感谢他们在评估MANTIS分液技术在Smart-seq3 流程中运用的做出的贡献，以及在此应用说明中提供的证明结果。