用SMART-Seq®单细胞技术推动单细胞RNA-seq的极限

将MANTIS®液体处理器集成到一个新的工作流程中，用于分析单细胞的全长转录组，使实验小型化

单细胞RNA测序(scRNA-seq)是一种用于研究单个细胞转录谱的技术。与传统的大群体测序不同，它强调了mRNA水平的细胞-细胞变异，更深入地了解健康和疾病的先决条件。scRNAseq的主要挑战来自于单个细胞只包含少量的mRNA。从极其有限的材料中提取有意义的生物信息需要具有特殊灵敏度和重现性的scRNA-seq制备方法。

为了解决这一需求，Takara Bio的研究人员开发了SMART-Seq®单细胞试剂盒(SSsc)。SSsc通过直接从单个细胞中生成高质量的全长cDNA，仅用2pg的RNA就能提供敏感且高重复性的结果。最近，通过将FORMULATRIX®旗下MANTIS®液体处理器集成到SSsc工作流程中，可以在不影响产量、灵敏度、重复性的情况下将反应体积缩小到原来的四分之一，进一步增强了这种强大的新一代测序技术的实用性。

SMART-Seq®单细胞试剂盒技术的几个优点

与现有的用于制备scRNA-seq样品的技术相比，SSsc有几个优点。这包括优越的灵敏度和重复性；一个简单的、模板化的工作流；以及不受小型化影响的强劲性能。

考虑到SSsc的灵敏性和重复性，Takara的研究人员已经证明SSsc比广泛使用的Smart-seq2技术检测到更多的淋巴母细胞系 (GM12878)基因，同时斯皮尔曼相关性系数显示SSsc具有更高的重复性( 图 1 ) 。在此对比分析 中，SSsc方法具有良好的精度，没有缺失值，在384个Cq值的标准偏差为 0.133，在0.5个周期内，99.5%的数据点都落在半圆内。这种性能尤其对RNA含量极低的细胞进行测序拥有极高的价值，它可以用来识别罕见的基因或检测单核苷酸多态性(SNPs)。

图1:SMART-Seq®单细胞试剂盒优于Smart-seq2。采用SSsc(18个细胞)或Smartseq2 (20个细胞; Picelli et al. 20141) 对淋巴母细胞系(GM12878)基因的gle细胞进行19个周期的PCR处理。如上所述，生成RNA-seq库，将所有样本标准化至175万双端reads后，分析se-quences。图a是在处理SSsc的细胞中检测到的更多基因。图B相关箱形图显示SSsc处理的细胞之间具有更高的斯皮尔曼相关性，这表明与Smartseq2相比具有更高的重复性。

一个简单的、模板化的工作流

SMART-Seq®单细胞试剂盒采用了一个简单的、模板化的工作流程，包括将细胞分配到预先准备的孔板上，反向转录RNA，然后通过PCR扩增得到的cDNA；然后在定量或者库准备之前对其进行纯化。图2总结了原始的、完整工作流程，橙色标记出了转移到MANTIS液体处理器上完成的步骤。

图2：SSsc工作流。使用MANTIS®液体处理器进行的步骤以橙色显示。

使用MANTIS®液体处理器，实现了稳健实验的小型化

通过将MANTIS®液体处理器引入SSsc工作流程，Takara的研究人员已经能够自动化三个关键的步骤：孔板制备、添加RT master mix、添加PCR master mix，如图2所示。这不仅提高了工作流效率，而且还使SSsc工艺能够转移到384孔板上，从而使反应体积减少到四分之一，获得更高、更有价值的灵敏度。

图3:MANTIS®显示移液管尖端通过小管连接到高容量(HV)芯片上。

使用MANTIS液体处理器运行的全体积 和四分之一体积SSsc工作流的性能类如 图4所示。在这两种情况下，每个细胞大约产生60-80 ng的cDNA，鉴定出的基因数量相似。从图5中可以看出，降低整体体积并没有降低灵敏度或重复性，强调了SSsc与小型化的兼容性。

四份已经详细制定的实验方案，规定了在MANTIS液体处理器上执行SSsc配件的分步工作流程，描述了96孔板中的全体积、半体积和四分之一体积反应大小，以及384孔板中的四分之一体积反应大小。这些实验方案可从FORMULATRIX网站下载。

图4:使用MANTIS®液体处理器进行全体积和四分之一体积移液的工作流程的相似产量和灵敏度。

图5:组内Pearson(图A)或Spearman(图B)在全体积或四分之一体积下处理的所有细胞之间的相关性表明，重复性和灵敏度不会因体积减少而受到影响。

SMART-Seq®单细胞试剂盒为进行全长转录组分析提供了许多好处，这种有价值的新一代测序技术的范围可以通过集成MANTIS液体处理器到SSsc工作流程，进一步扩展。通过将SSsc的灵敏度和重复性与MANTIS液体处理器提供的样品处理效率、更小的反应体积相结合，研究人员可以实现对珍贵样品材料越来越详细的表征。

可以从FORMULATRIX网站的参考资料页面下载使用Smart-Seq®单细胞试剂盒在MANTIS液体处理器上的全体积、半体积、四分之一体积和384-孔板四分之一体积的详细实验步骤。