蛋白质晶体的多荧光成像

蛋白质结晶成像

生物晶体明确且可靠的鉴定仍然是晶体学研究的一个主要障碍，特别是在实验初步筛选的关键阶段。在可见范围内的高分辨率自动成像往往不足以识别所有产生或可能产生晶体的条件。

晶体学家经常依靠芳香族氨基酸的固有荧光，如色氨酸，来区分盐晶和蛋白质晶体。紫外荧光成像检测色氨酸的荧光，并在许多情况下产生高对比度的图像，有助于表征结晶液滴。在某些情况下，蛋白质含有很少的色氨酸氨基酸，或者根本没有，无法使用紫外荧光成像。在蛋白质中添加荧光分子，可以在很短的成像时间内获得高对比度的图像，且样品没有损伤。

蛋白质的染料标记

有许多方法标记蛋白质与荧光染料，范围从非常简单没有纯化步骤的实验方案，到利用利用色谱柱去除多余的染料等涉及更多步骤的方法。一种简单的方法是将琥珀酰亚胺酯染料在DMSO中溶解，然后将其直接添加到自己的蛋白质溶液中，等待5分钟，然后照常分配蛋白质。Formulatrix成像仪在检测荧光时非常灵敏，因此只需要标记0.1%的总蛋白即可。

在向蛋白质中添加染料时，重要的是要使用不包含竞争性反应性胺且pH值为7至8的缓冲液。据观察，在等待 5分钟后，当标记率低于所有赖氨酸的1%时，超过80%的染料已经被标记到蛋白质上，这使得从溶液中去除多余的染料不是必要的。比率大于1％的标记将导致反应性酯的不完全水解，并导致溶液中过量的未结合染料在成像时产生强烈的荧光背景。0.1％至0.3％的标记足以用Formulatrix成像仪生成高对比度图像。标记率的提高只会降低图像质量和/或需要纯化以去除过量的染料。当pH值非常低或非常高时，会极大影响标记效率，导致标记完全失败。当pH值约为6.5可能会导致蛋白质氨基末端的选择性标记。最佳的pH值范围在7.0至8.4 之间，这将有助于达到预期的结果。

通常来说，利用小分子修饰蛋白质的想法是会令人不安的，会引起是否对结晶和构象产生负面影响的担忧。这里描述的方案和例子是0.1%的可用赖氨酸被标记的蛋白质，结果对其余99.9%的蛋白质影响很小。话虽如此，这也不是一个完全受控的过程，可以想象标记蛋白的构象会受到不同染料附着位置的影响。值得注意的是，这是赖氨酸与染料结合的一个相对随机的过程，其构象会发生变化，但与99.9%未标记的蛋白质相比，仍在统计学上并不相关。晶体学是一种平均技术，其最终结构是晶体中每个分子的平均。

因此，0.1%蛋白质的异常将被平均掉，而不会影响最终的整体晶体结构。

此外，衍射质量的晶体是由非常均匀的蛋白质分子组成的。这意味着，如果标记影响了蛋白质的结构/构象，被标记的蛋白质将不会率先进入晶体。反之亦然，如果标记的蛋白质最终处于衍射晶体中，其构象将与未标记的蛋白质几乎相同，而不会对晶体结构产生不利影响。这是预期的结果，也是该技术所依赖的。

多荧光成像

Formulatrix成像仪提供了对三种不同波长的结晶板进行自动成像的功能。这使得科学家可以利用紫外通道和其他两种可见光波段的固有荧光。光学器件设计用于紫外和可见荧光成像，每个通道都有单独的光源，以提高灵敏度。当对结晶板成像时，滤镜立方体会自动切换，并且可以完全自定义使用目标染料（图1）。

图1. 具有3个完全可定制的滤光器模块自动切换的多 荧光光学路径。

蛋白质-蛋白质复合物检测通过多荧光成像得以简化。一个人操作就可以简单地用不同的荧光团标记每个蛋白质，图像上都有可见的荧光通道，只要发现荧光重叠，就可以知道这两种蛋白质都存在于晶体中（图2）。

图2. 蛋白A-蛋白B复合物晶体，其中蛋白A标记为texas red，蛋白B标记为荧光素。

荧光染料的选择和影响

可以根据所使用的蛋白质、pH值范围和成本来选择染料。同样重要的是，确保如果使用两个不同的染料有最小光谱重叠。通常来说，所有的N-羟基琥珀酰亚胺酯缀合染料在水溶性条件下都是有效的标记。荧光素和texas red是两种便宜的染料，在光谱上是分离的，并能产生良好的结果。然而，它们确实表现出了对pH依赖性，荧光素对pH小于7.0特别敏感，pKa为6.4（图3），因此在各种蛋白酶抑制剂Cocktail的条件下筛选并不理想。Alexa 488和Alexa 594是两种光谱分离染料的好选择，在各种条件下都能很好地工作， 并且在pH4和10之间没有pH依赖性。

图3.荧光素的pH依赖性光谱：A）吸收光谱，B）发射光谱。

膜蛋白的标记

膜蛋白的标记不像可溶性蛋白那么容易。对于膜蛋白来说，可能无法获得大量的赖氨酸残基，这使得难以确定要添加的正确染料量。而且，大多数荧光染料包含高度疏水的芳族环，该芳族环通过与带电基团连接而变得水溶性。因此，许多染料会分解成疏水性去污剂微团或微细胞，导致溶液中的有效浓度发生变化，未反应染料的浓度变高。Cherezov在他的FRAP 分析方法论文中解释了一个标记膜蛋白的有用例子。

用可见荧光屏蔽

使用荧光染料提高了灵敏度，因此在筛选时更容易找到晶体。例如，与周围的沉淀物相比，由于小晶体中蛋白质的浓度较高，因此可以区分掩埋在沉淀物下的小晶体（图4）。使用高倍物镜也可以看到高分辨率小晶体。大范围的变焦值允许液滴自动定位，然后以更高的稳定性成像。还可以以更高的分辨率查询自定义的感兴趣区域，以产生更精细的细节和对比度（图5）。

图4.小的蛋白质晶体在可见的荧光图像中可视化，否则在传统的明场图像中将看不到。

图5. Formulatrix成像仪中的大视野范围使液滴可以自动成像，并且可以定义感兴趣的自定义区域以产生更高分辨率的图像。

结论

多种成像技术可用于筛选蛋白质结晶板，包括可见光、双折射光、紫外荧光和可见荧光成像。用小分子荧光团标记很小百分比的蛋白质的能力使人们可以检测高蛋白质浓度的区域。染料标记的蛋白质发出的荧光可以很容易地区分蛋白质和盐晶，也可以找到隐藏在沉淀物下的小晶体。当处理蛋白质-蛋白质复合物时，它也是一个很好的工具。人们可以简单地使用不同染料标记每个蛋白质，然后成像，以查看它们在哪里发现荧光的共定位。这样就可以确定晶体是否同时包含两种蛋白质，且无需进行XRD表征。0.1％的标记率对晶体质量和蛋白质结构输出几乎没有影响，使其成为一种非侵入性方法。

0.1%标记示例-溶菌酶

1. 在DMSO中溶解染料，形成5mM的原液

2. 用溶菌酶的MW常数为14.7kDa (147000 g/ mol)，可以将20 mg/ml溶菌酶溶液转化为1.36 mM

3. 假设对氨基残基的标记效率为1:1，并利用溶菌酶有6个赖氨酸，100%标记所有活性位点等于8.16 mM

4. 如果只需要标记0.1%的位点，则染料的添加浓度应为8.16μM

5. 在250μL的20mg/ml溶菌酶溶液中加入0.4μL 5mM染料，蛋白标记率为0.1%