湿度对蛋白液滴蒸发的影响

蒸汽扩散现仍是用于生长蛋白质晶体以进行X射线衍射的最常用技术。在这种方法中，将蛋白质溶液与储液混合，将这种混合物的小体积液滴与体积较大的储液平衡。液滴溶液具有较低的溶质浓度，与储液溶液相比具有较高的蒸汽压，这导致水随着时间的推移从液滴扩散到储液溶液，直到两者达到平衡。液滴的水分蒸发导致蛋白质和沉淀剂浓度的增加，使蛋白质通过亚稳相进入晶体成核相。

平衡速率取决于几个因素：所使用的沉淀剂的类型和浓度、温度、湿度、液滴和储液器之间的距离、以及液滴：储层体积比2。在结晶板的设置过程中，液滴的蒸发会导致液滴与储层体积比的不良变化。对于给定的储层体积，较小的液滴平衡更快，在有利于晶体形成的条件下，可能会引发过度成核，从而导致更小的晶体尺寸。由于局部蛋白质或沉淀剂浓度高，大量的水蒸发可能导致蛋白质变性，形成盐晶体（例如硫酸铵晶体），液滴表面形成皮肤，或液滴干燥。

直接影响水滴蒸发速率的因素是相对湿度（RH）。高RH在设置结晶板，可以减缓蒸发过程。结晶板放置的房间里的RH通常没有严格的规定，而且会随着季节的变化而变化。这可能会导致结晶试验结果的差异，从而对实验的可重复性产生负面影响，这是目前科学界面临的一个主要问题。

在蛋白质晶体学中使用机器人来处理液体，提高了液滴分配的准确性，并加快了结晶板的制备速度，以避免大量的水滴蒸发。然而，即使提高了液滴分配的速度和准确性，平均仍需要2-10分钟才能完成每液滴1-3 滴的96-孔板的制备。一些结晶机器人，包括富默乐的NT8移液工作站，可以在制版过程中精确控制湿度，显著减少液滴蒸发。湿度通过限制需要优化的变量控制，提高了可重复性，因此实验结果不再依赖于结晶板上的分液位置、时间准备，或者制备时所处的季节，而主要受成分浓度和体积的影响。

在本应用手册中，我们评估了湿度对结晶板制备过程中液滴大小和组成的影响。

实验设置

为了测试不同沉淀剂对液滴蒸发速率的影响，我们选择了三种溶液:

1. 0.5 mM荧光素，10% DMSO, 100 mM Hepes pH 7.5

2. 0.5 mM荧光素，10% DMSO, 100 mM Hepes pH 7.5, 20% PEG 10K

3. 0.5 mM荧光素，10% DMSO, 100 mM Hepes pH 7.5, 1.6 M硫酸铵

它们在这里分别称为缓冲液、聚乙二醇和硫酸铵。

使用富默乐的NT8滴定仪在结晶板上分液。在LCP夹层板(Hampton HR3-1510)上分配200 nL和1μL体积的液滴。目的是研究在10分钟内液滴蒸发的情况，这是滴落器准备96-孔板（每孔3滴）所需的平均时间。为了达到这个时间范围，在每列分液之后，机器人需要等待40秒钟才能继续分配。之所以选择LCP板，是因为夹层的组装可以防止快速滴蒸发，从而在液滴体积明显损失之前有时间对板进行成像。此外，液滴被压下，液滴的厚度是均匀的。因此，液滴面积可以用来估计从不同的孔板和有不同的成分液滴之间的体积变化。否 则，就必须考虑液滴的形状，包括水滴的不同厚度。

用来自富默乐的FRAP成象仪在荧光素激发和发射波长分别为485nm和524 nm的荧光模式下对孔板进行成 像。不同孔板的曝光时间不同。根据孔容量的不同，液滴成像时间为400-2000 ms，以获得液滴与孔底之间的高对比度。将增值设置为1。每个液滴在15个聚焦层上成像，并将所有图像合并为一个扩展聚焦图像，用于计算液滴的表面积。来自荧光素的强烈荧光信号可以方便和精确地定位液滴位置。

使用ImageJ软件测量液滴大小。对于每一滴水（每孔板96滴），液滴图像被转换为8位灰度。想测量的对象的强度阈值设置为40-255范围。计算大于1000px的颗粒的粒径，每个孔仅需进行一次测量即可反映出液滴的大小。对于每个时间点，设置8个独立的液滴，测量每个液滴的表面积，并基于这些测量结果计算平均液滴大小。实验误差计算为获得值的标准偏差。液滴大小与液滴平均大小相差50%以上的液滴被排除在最终计算之外（1728次测量中有25次）。液滴的体积损失表示为平均液滴面积除以最后分配在孔板上的液滴面积（参考液滴）的百分比。

结论

1. 在有和没有湿度控制的情况下设置的液滴蒸发速率。

在设置为环境RH或85％RH（由NT8湿度控制室确保）的控制上，随时间监测结晶液滴的大小。在环境相对湿度下，开始制备孔板后的1.8分钟内，对于所有测试条件，200 nL的25％的滴液和1μL的15％滴液已蒸发（图1）。2.7分钟后，大概是分配一个每孔1滴的96-孔板所需的时间，对于200 nL液滴，蒸发了29％ 的PEG，32％的硫酸铵和39％的缓冲液条件（表1）。

1μL时的液滴损失略低，在18％至25％之间变化。6.3分钟后，在200 nL /1μL液滴中，PEG的液滴损失增加至42/41％，硫酸铵的液滴损失增加至52/43％，缓冲液的液滴损失增加至55/48％。

将相对湿度从环境RH（50％）增加到85％RH会显着降低液滴的蒸发速率（图1）。在85％的相对湿度下 2.7分钟后，在任何条件下（0-3％，这均在实验误差范围内），液滴尺寸均无明显下降。6.3分钟后，对于200 nL液滴，液滴大小减小0-10％，对于1μL液滴，液滴大小减小2-7％，与环境RH中的液滴损失相比，下降了约5倍。在此实验装置中，溶液类型与蒸发速率之间没有显着相关性。

图1. 对于3种不同的溶液，在2个RH设置（环境RH为50%和RH设置为85%）中，在10分钟过程中剩余的200 nL(上)和1μL(下)滴度的百分比。误差条表示实验重复8次后液滴面积的标准差。

表1. 在2.7分钟和6.3分钟时，液滴蒸发与参考液滴相比的百分比。

2. RH为95％的液滴大小

我们还评估了在95％的湿度下随时间流逝的液滴损失。在这种湿度设置下，孔板上会覆盖薄雾，这可能会造成液滴吸收水分而导致液滴尺寸增加。但是，在95％的湿度下，1μL液滴的液滴大小没有明显增加。相反，在200 nL液滴中，有40％的液滴大小与参考液滴相比增加了5％以上。对于在95％RH条件下 在板上停留超过9.0分钟的液滴，观察到PEG和缓冲液200 nL液滴的大小增加，而对于硫酸铵，是在3.6分钟后观察到液滴大小增加。

3. 在夹层组装之前，为PEG和硫酸铵干燥的液滴百分比

在室温下的某些条件下，在制备孔板的过程中，选定的液滴会变干。在200 nL PEG条件下，一些液滴在 2.7分钟后变干（表1）。6分钟后，最初的1μL液滴变干 4.5分钟后，硫酸铵滴200 nL和1μL开始干燥。缓冲液滴的大小有所减小，但在10分钟的实验过程中并未完全变干。总之，在孔板制备的10分钟后，平均38％的PEG液滴和58％的硫酸铵液滴被完全干燥（图2）。此外，在制板5分钟后，硫酸铵晶体开始在200 nL 液滴中出现（图3）。相反，在将RH设置为85％的受控RH环境中设置的任何条件下，滴液都不会变干，也不会形成盐晶。

图2. A)环境RH为50%，B)孔板制备10分钟后，相对湿度为85%。从左到右依次为200nl，1μL硫酸铵条件，200nl, 1μL PEG条件。

图 3. 结晶板制备 5分钟后硫酸铵晶体的形成。

结论

本文中，我们研究了RH对制版过程中结晶液滴蒸发的影响。在2.7分钟后，在环境RH中设置的200 nL和1μL 液滴平均损失了32％和22％的体积，而在85％RH条件下，没有观察到液滴体积的损失。值得注意的是，市售移液器制备96-孔板每孔1滴所需的平均时间为2-3 分钟。当在室温RH条件下蒸发49％的200 nL液滴和44％的1μL液滴后，这种液滴大小差异在6.3分钟后变得更加明显。然而在85% RH下，200 nl的液滴只有7%蒸发，1μL的液滴只有5.3%蒸发。液滴损失的这种显著减少大大影响了液滴中溶质的浓度，这影响了液滴蒸发的速度，在极端情况下可能导致蛋白质变性。在这种情况下，无法获得结晶并不是原始条件不适合结晶形成的结果，也不能准确地代表筛选出的结晶空间来选择好的结晶条件。但是，可以通过使用高于环境湿度的RH来避免此问题，正如我们已展示的那样，RH可以减少液滴的蒸发。湿度控制室是富默乐 NT8移液器的一部分，使用户可以在制版过程中精确控制湿度水平。