木樨草苷

二极管阵列检测器——从现象到本质看木犀草素沈国滨 施磊 金燕 01紫外检测器的进阶版本——二极管阵列检测器(Diode Array Detector, DAD)紫外检测器(Ultraviolet Detector, UV)是目前HPLC应用最广泛的检测器，其工作原理是朗伯-比尔定律。紫外检测要求被检测样品组分具有紫外吸收，通常选择在被分析物有最大吸收的波长处进行检测，以获得最大灵敏度和抗干扰能力。可惜这会导致其它组分在该通道下的吸收变弱甚至无紫外吸收。因此，单通道紫外检测器在对目标化合物，特别是未知化合物进行纯度及定量分析时，结果可能会产生严重的偏差。图1 朗伯-比尔定律（A=lg(1/T)=Klc） 二极管阵列检测器(Diode Array Detector, DAD)是一种新型的光吸收检测器，它采用光电二极管阵列作为检测元件，形成多通道并行工作，可对光栅分离的所有波长的光信号进行检测，从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长。可得任意波长的色谱图及任意时间的光谱图，具有色谱峰纯度鉴定、光谱图检索等功能，为定性、定量分析提供更丰富的信息。图2 二极管阵列检测器 02 DAD在天然产物构型变化监测时的妙用独一味（学名：Lamiophlomis rotata）是唇形科独一味属植物，有活血祛瘀，消肿止痛的功效，是青藏高原特有的一种重要药用植物。木犀草素是独一味叶中的主要成分 (Luteolin, CAS No. 491-70-3 )，是一种天然弱酸性的黄酮类化合物。木犀草素具有抗炎、抗过敏等作用，可用于治疗COPD、支气管哮喘以及慢性咽炎、变应性鼻炎等引起的慢性咳嗽。图3 木犀草素结构式本文基于赛默飞液相色谱系统和二极管阵列检测器，开发了一种可用于检测中药独一味胶囊提取液中木犀草素含量的方法。通过DAD检测器不仅可以实现定量分析，也可以用于色谱峰的定性分析。同时利用DAD全波长扫描的结果以证实木犀草素在流动相pH变化时会发生最大吸收波长红移，从而影响其在C18色谱中的保留等现象进行解释。 03 实验部分色谱条件流动相pH值对色谱行为的影响图4 流动相不同pH对于保留时间和吸收波长的影响 实验结合文献表明木犀草素对于流动相的pH敏感，依据计算模拟表明木犀草素的pKa 为 6.5±0.4。即在中性时，部分木犀草素可能以极性较强的离子形式存在，保留较弱；当调节pH为酸性时，抑制了电离，使得该分子以分子形式存在。借助二极管阵列检测器（DAD），可以实现全波长扫描，可以获得更全面的紫外光谱信息。木犀草素的紫外吸收波谱也对流动相的pH敏感，不仅保留时间产生了较大的差异，且随着碱性增强，最大吸收波长产生红移。表明该物质会在不同pH条件下产生不同的构象，且构象的变化会引起共轭结构的变化。 样品分析结果图5 标准品与样品对照色谱图（蓝色：标准品，黑色：样品） 图6 样品DAD三维色谱图（插图：8.640分钟的紫外吸收光谱图） 木犀草素保留良好，色谱峰形对称，无杂质干扰，可用于定性和定量分析。在0.3~100 μM 的范围内线性良好，相关系数R2达0.9999。进样精密度良好，标准品和样品的保留时间RSD均小于为0.2 %，峰面积RSD均小于为0.9 %。根据分析标准品保留时间的紫外吸收光谱，可见样品中对应色谱峰的最大吸收波长与木犀草素一致，推断该物质为木犀草素。根据校正曲线计算可得独一味胶囊提取液中木犀草素的摩尔浓度为27.4 μM。通过在样品中加入已知浓度的标准品来判断方法的准确性，该方法的回收率在95.9~103.0%之间。 04 结论本文基于赛默飞液相系统和二极管阵列检测器，开发了一种可用于检测中药独一味胶囊提取液中木犀草素含量的方法。通过DAD检测器不仅可以实现定量分析，也可以用于色谱峰的定性分析。利用DAD全波长扫描结合其它有关计算，验证了木犀草素在不同pH条件下最大吸收波长产生了红移，从而影响其在C18色谱中的保留。本文报道的方法能为极性小分子检测方法的开发提供定性和定量分析实验基础，为阐明色谱柱中的保留机理提供了理论依据，凸出了全波长扫描DAD检测器在分析物质变化过程和监测反应过程时的优势。

今日，北京市食药监局通报江西草珊瑚药业有限公司生产的江绿甘草片，甘草酸的实测值只有标准值的4%。　　甘草是日常人们用户缓解嗓子不舒服的常用药品，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药，含量不足，药效也大打折扣。日常老百姓对药品的含量了解主要以药品标签为参考，并无直接测定的工具及途径，相关政府部门加大对药品生产企业及经营企业的抽检力度可在一定程度上保证人们的用药安全和药效。　　按照现行《中国药典》，甘草主要采用液相色谱法测定其中的甘草苷(C21H22O9)和甘草酸(C42H62O16)，以干燥品计算，甘草苷(C21H22O9)不得少于0.50%，甘草酸(C42H62O16)不得少于2.0%。　　附：《中国药典》关于甘草的测定方法　　色谱条件与系统适用性试验： 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱 检测波长为237nm。理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000。　　对照品溶液的制备： 取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%乙醇分别制成每1ml含甘草苷20&mu g、甘草酸铵0.2mg的溶液，即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。　　供试品溶液的制备： 取本品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。　　测定法： 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10&mu l，注入液相色谱仪，测定，即得。　　本品按干燥品计算，含甘草苷(C21H22O9)不得少于0.50%，甘草酸(C42H62O16)不得少于2.0%。

我要测讯 金银花，忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，主要成分为绿原酸和木樨草甘，是名贵药材之一。由于中药方剂中多用刀金银花，并且今年由药用转向食用和日用化工等因素，价格持续上涨，由此掺假现象也屡被发现。山银花与金银花外貌相似，其主要成分为绿原酸，多被不法商贩掺入金银花中，代替金银花。虽然山银花也为药材，但因其成分中不含木樨草甘，在药用价值和价格上还是有别于金银花。金银花金银花的检测方法(高效液相色谱法)　　一、实验原理　　试样经粉碎、过筛后，采用甲醇-水溶剂超声提取，后高效液相色谱法测定其中四种组分的含量值，再根据药典规定鉴别其真假判定其质量，主要区别金银花和山银花。　　二、仪器和试剂　　高效液相色谱仪带紫外检测器，AS3120超声波发生器 甲醇为色谱纯试剂，实验用水为超纯水。　　三、试验方法　　1. 提取　　测定绿原酸、木犀草苷提取条件为：将样品充分粉碎，粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人50%甲醇50ml,称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得A, 上机测定得到绿原酸、木犀草苷的液相色谱图见图1A/B/C。　　测定灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙提取条件为：将样品充分粉碎，粉末(过四号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人50%甲醇50ml,称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得B, 上机测定得到灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的液相色谱图见图2。ABC图1 标准溶液绿原酸(A)、木犀草苷(B)和样品溶液的液相色谱图(C)AB图1 标准溶液灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙(A)和样品溶液的液相色谱图( B)　　2 仪器参数　　2.1 测定绿原酸、木犀草苷液相色谱条件　　色谱柱： Aglient TC- C18 (250×4.6mm，粒径5μm) 　　检测波长： 350nm 　　流动相:甲醇-水(含有2mmol/L硫酸)(梯度洗脱) 　　流速：1.0mL/min　　进样量：20μL。　　2.2 测定灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙液相色谱条件　　色谱柱： Aglient TC- C18 (250×4.6mm，粒径5μm) 　　检测波长： 203nm　　流动相:甲醇-水(含有2mmol/L硫酸)(60:40) 　　流速：1.0mL/min　　进样量：20μL。　　3 结果计算和评价　　采用外标法计算各种物质的含量，再根据下表作出评价。名称绿原酸木犀草苷灰毡毛忍冬皂苷乙灰毡毛忍冬皂苷乙+ 川续断皂苷乙金银花限量指标（%） ≥1.5≥0.05不得检出不得检出山银花限量指标（%）≥2.0不限 不限 ≥5.0　　4 检出限　　本方法仪器最低检测浓度绿原酸、木犀草苷为1 μg/mL，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙为10 μg/mL，按照上述样品前处理计算，本方法检出限绿原酸、木犀草苷为0.01%。灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙为0.1%。　　附图：　　1、样品粉碎　　2、检测仪器——高效液相色谱仪　　3、测试谱图　　附：中国广州分析测试中心　　中国广州分析测试中心(简称中广测)——在广东省测试分析研究所基础上建立的国家级的分析测试中心，是以理化分析测试为重点的综合性研究和服务机构，已有50年历史。　　中广测于1990年通过省级计量认证，1991年通过国家级计量认证，2001年通过中国实验室国家认可。经过多年的发展，中广测目前已成为通过国家级资质认定(CMA)和国家认可(CNAS)的第三方检测、校准实验室和A类检查机构，可向社会提供具有证明作用的测试数据和结果。中广测的管理体系符合ISO/IEC 17025和ISO/IEC 17020的要求，因而也是依据ISO 9001运作的。根据中国合格评定国家认可委员会与美国、欧盟、日本等国家和地区的认可机构达成的互认协议，中广测出具的数据和结果可获得广泛的国际互认。撰稿人：中广测 高级工程师 黄芳 我要测 杨改霞