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[align=center][b]材料中真菌类型鉴定试验分析[/b][/align][align=center]西安国联质量检测技术股份有限公司[/align][align=center]食品事业部:张锐[/align][b]1 检验方法[/b]1.1菌种分离1.1.1 用浸湿生理盐水的无菌棉签在材料板表面涂抹,放于10mL无菌蒸馏水中,充分混匀备用。取原液1.0mL加入9.0mL无菌蒸馏水中,充分混匀为1:10样液,依次稀释至10[sup]-[/sup][sup]2[/sup]或10[sup]-3[/sup]的样液。1.1.2 取适当稀释度样液100μL于PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂)涂布,25℃培养,连续观察,对不同形态的菌落进行分离、纯化。1.2 形态学鉴定1.2.1 将分离的不同菌株分别接于PDA培养基25℃培养7d观察菌落形态,并待产孢后,在显微镜下观察分生孢子、产孢器及其产孢细胞的形态。1.3 分子鉴定1.3.1 DNA提取: 取200g菌丝,液氮研磨,将研磨好的菌至 1.5mL离心管中混匀,加入 0.6 mL TE(pH 8.0)、 250 μL 10% SDS、3 μL 蛋白酶 K(20 ng/μL),轻轻混匀,37℃水浴 1 h;加入 150 μL 5mol/L NaCl、 150 μL 2% CTAB,轻轻混匀,65℃水浴 20 min,12000 rpm 常温离心 20 min;吸取上清液加入等体积异丙醇,充分混匀,室温放置 30 min,12000 rpm,4℃离心 10 min;吸掉上清液,在吸水纸上空干液体,加 750 μL 70%乙醇,轻弹管壁混匀,12000rpm,4℃离心 2min;加入 30 μl 纯化水溶解沉淀(水中加 Rnase,终浓度 10 ng/μL),用手轻弹管壁,4℃溶解保存。 利用真菌通用引物ITS1(5'-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A -3')、ITS4(5'-TCC TCC [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]T TAT TGA TAT [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]-3')和真菌特异性引物5.8s(5'-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]A TCG ATG AAG AAC [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]A [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]-3')、28s(5'-TCC TCC [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]T TAT TGA TAT [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]-3')分别对J2和J4基因组DNA进行PCR扩增,其扩增体系为:3 μLBuffer,2 μLDTP,引物各3 μL,DNA模板1 μL(以加1 μL双蒸水为空白对照),最后用双蒸水定容到30 μL。扩增程序为:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后,对具特异性条带的产物进行测序。将测序结果与GenBank中的相关序列进行同源性比较,明确其种类。[b]2 结果与分析[/b]2.1 菌种分离2.1.1 经涂布法分离培养,在2种材料上均分离得到5株相同菌株,分别编号为J1、J2、J3、J4和J5。J1在油漆试件和辅助电源板黑色镶嵌模块材料上生长良好,分离频率均最高,表明2种材料均能促进J1菌丝生长,其次为J2;在油漆试件材料上J3分离频率为0,表明油漆试件材料能抑制J3 菌丝的生长;J5在2种材料上的分离频率均最低,表明2种材料对J5菌丝的生长促进缓慢(表1)。[align=center][img=,609,164]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709111103_01_2904018_3.png[/img] [/align]将菌株在PDA培养基上25℃培养7d后,经形态学比对,将J1鉴定为黑曲霉,将J3鉴定为黄曲霉,将J5为鉴定杂色曲霉,均为试验菌株。J2菌落圆形,7d菌落直径4~6cm,菌丝絮状,初生菌丝白色,后变为黄色、黄绿色,培养基背面淡黄色,分生孢子穗半圆形、圆筒形,小梗1层或2层,顶囊半球形、圆拱形至球形,分生孢子球形;J4菌落圆形,7d菌落直径4~5cm,菌丝细,絮状,白色,不易产孢,产孢器扫帚状,分生孢子梗轮生,分生孢子球形。2.2 形态学鉴定2.3 分子鉴定 利用引物ITS1/ITS4和5.8s/28s分别对J2和J4基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测(图1),以DNA Marker-DL5000为对照,具特异性条带的扩增产物进行测序,将测序结果在GenBank中进行同源序列比较,下载相似性高的序列,并用Mega(5.0)软件采用邻接法构建系统发育树。结果显示,J2 ITS基因扩增序列为607 bp,与[i]Aspergillus oryzae[/i] (KF154415.1)相似度达99%,在系统发育树上聚在一起(图2);J4 5.8s/28s扩增序列349 bp,在GenBank中经同源序列比较发现其与[i]Talaromyces macrosporus[/i](KX011505.1)的同源性在98%以上,且在系统发育树上与其聚在一起(图3),即二者亲缘关系最近。结合形态特征,将J2鉴定为米曲霉[i]Aspergillus oryzae[/i],将J4鉴定为篮状菌[i]Talaromyces macrosporus[/i]。[align=center][img=,536,478]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709111105_02_2904018_3.png[/img] [/align][align=left]3 讨论[/align]不同的供试材料能为菌株生长提供养分,该试验对接种5种试验菌株的材料在高温高湿的环境下处理,确定材料在有利于霉菌生长的条件下霉菌对他们产生的有害影响。试验结果表明,2种试验材料均能促进黑曲霉菌丝的生长,其次为米曲霉,对篮状菌菌丝生长促进缓慢;均能抑制绳状青霉、球毛壳霉菌丝的生长。菌株是否可以在材料上良好生长取决于供试材料能否提供该菌所需要的营养类型和培养环境是否满足菌株生长。该试验分离得到的菌株分离频率越大,表明该材料越能为菌株生长提供养分,但菌株是否对材料产生有害影响,需观察菌株对材料物理性质的影响。
[align=left][b]简介[/b][/align]随着人民生活水平的提高,社会的进步,食品中微生物污染造成的[url=http://www.cnfoodsafety.com/]食品安全[/url]问题也越来越受到广大消费者、食品企业、政府监管部门的关注。食品变质原因90%是由微生物(细菌、真菌等)引起的,在此大环境下,食品加工企业要不断提高企业管理水平,保证所生产出的产品安全合格。[b]真菌[/b]说到真菌,很容易想到细菌,因为它们都能引起食品变质。其实真菌与细菌有本质上的不同,这种差别显示了生物进化历程:显微镜下可见细菌形态单一,呈球状或棒状;真菌形态比细菌复杂,有菌丝、芽胞等结构。所以真菌比细菌更难杀灭。真菌,是一类有细胞壁,不含叶绿素,无根叶茎,以腐生或寄生方式生存,能进行有性或无性繁殖的真核微生物。真菌中最常见的是各类蕈类,另外还有霉菌和酵母。世界上已被描述的真菌约有 1万属12万余种。真菌的危害在食品加工行业中是时时存在的。因为在空气中,水中,原料中都有真菌的孢子存在。遇到适宜的环境,即可繁育。同时,真菌通过产生真菌毒素也给人体健康带来危害。[b]食品生产过程中的真菌[/b]真菌在过去曾称为霉菌,是微生物中的一个大类,是一群数目庞大的细胞生物,估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的个头差别很大,小者用显微镜才能见到,大者可达数十厘米,如茯苓、蘑菇等。以食品行业为例,霉菌会造成食品腐败变质,是造成食品工业巨大经济损失的主要腐败微生物。霉菌污染频繁出现在食品、饮料、海产品、肉制品、熟食和新鲜的蔬菜中,每年都会给生产者和消费者造成极大的经济损失。霉菌除了会引起肉眼可见的腐败变质外,还会产生一些真菌毒素类物质,目前研究已经确定有超过200种霉菌在食品中生长时会产生对人体有害的物质,主要有黄曲霉毒素类、串珠镰刀菌素、赫曲霉毒素、棒曲霉素、单端孢煤烯类和玉米赤霉烯酮六大类。由于这些霉素具有致癌致畸形、同时对神经、肝肾也有毒害作用,因此这些腐败真菌给食品工业造成了巨大经济损失,同时也对公众的健康构成了极大危害。据统计,25%的农产品都含有霉菌毒素,在烘烤行业,霉菌造成的损失随着季节、产品种类、加工方法的不同在3%—10%之间浮动。假设仅有1%的损失,在英国每年由霉菌造成的污染的面包就有23000吨,价值2.42亿英镑。在澳大利亚每年由霉菌造成的经济损失大约在1千万美元。在水果行业,水果采摘后的使用杀菌剂的条件下也会有5%—10%的损失,在某些没有使用杀真菌剂的年份,损失达50%甚至更高。[b]食品厂杀灭真菌的方法[/b]食品加工厂生产车间温度、湿度适宜且营养物质丰富,较容易生长繁殖微生物,稍不加注意洁净车间卫生条件,很容易受真菌污染,导致食品腐烂变质。特别是食品厂霉菌因其特性一般的消毒剂很难对付。然而过氧化氢银离子复合型杀菌消毒剂杀孢子剂具有强烈杀灭食品厂真菌的作用,彻底分解不产生耐药性,并且对人健康无害,无色无味,无毒无残留,安全绿色环保,是新一代进口食品级消毒杀菌剂。[b]奥克泰士[/b]奥克泰士是进口德国,专为食品厂设计,奥克泰士配合空间、环境、物表等可达到食品企业消毒灭菌的要求,近来深受食品企业的青睐。奥克泰士杀菌消毒剂是由食品级过氧化氢和银离子组成的复合型溶剂,食品级无色无味无毒无残留型,IFS国际食品标准认证,欧盟EMAS检测认证等。所采用的氧化剂为过氧化氢,它与稳定剂结合形成复合溶液。作为催化剂添加的痕量银离子可以保持长久的效用。银离子的杀菌作用是基于单价银离子通过共价键和配位键来与细菌蛋白质牢固结合,从而使细菌钝化或沉淀。能在食品厂洁净区消毒中迅速杀灭一定空间内的的微生物(包括芽孢)或者抑制微生物繁殖的进口高效消毒剂。德国BUDICH INTERNATIONAL GMBH研制、生产,是目前国际上一款卓越的杀菌消毒剂。由于其独特的作用原理,能够快速杀灭包括芽孢、细菌孢子、真菌孢子、放射菌、分支杆菌、酵母菌、霉菌、病毒在内的所有类型的微生物。做为新一代生态环保的消毒剂在欧美发达国家早已成熟应用。在欧盟食品企业已经完全禁止甲醛的大环境下,奥克泰士是目前众多欧盟食品企业的首选。也代表着过氧化氢银离子复合型杀菌消毒剂发展的新方向。产品技术引进国内短短几年。目前在食品饮料、制药安全、医疗卫生等国内众多高端灭菌领领域顺速推广。奥克泰士己成分中国食品企业杀菌消毒的首选。可用于洁净室空间和生产设备、各类洁净区物表消毒和空间消毒;操作台表面消毒。适用领域包括食品、食品设备、食品企业动态环境、食品企业生产等。也可用于不锈钢、钢、塑料、玻璃、地板、墙壁等各种表面的消毒、灭菌等。[b]奥克泰士特点[/b]1、它能够有效杀灭细菌、病毒、变形虫、真菌及藻类,其十分广泛的应用领域使得用户便于操作处理。只需采用一种产品,便能够达到目前2种、3种甚至多种产品的使用目的。2、由于产品具有良好的稳定性,因此保证了长久的贮藏时间。产品在高水/气温度下仍能保持稳定;甚至在高温下,其效用还会有所增强。3、由于产品在防止再污染方面具有长久的有效性并且性能卓越,因此,产品非常适合用于饮用水与井水的消毒。4、过氧化氢银离子复合型杀菌消毒剂型产品是生态无害的。对防止水受细菌和病毒的再污染特别有效。其主要成分-过氧化氢-不会污染废水。这是由于它会分解成为水和氧气(H[sub]2[/sub]O和O[sub]2[/sub]),即,其副产物不具毒害性。5、两种基本物质(H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]和Ag)进一步促进了各自的优势(*协同作用)。两种物质的协同作用比其中任何一种物质单独作用要具有更快、更强的杀菌作用。*协同作用—两种或多种组份用以提高和增强效用6、过氧化氢银离子复合型杀菌消毒剂为在氧化和微动作用相结合的情况下所制成的两相产品——不同于其它消毒剂——具有破坏生物被膜的功效。这是杀菌消毒的一个重要步骤,因为细菌或病毒会产生出这种生物被膜作为自然防护。由过氧化氢所分离出的氧气会破坏生物被膜,使得银离子能够轻易地杀灭细菌或病毒。
细菌:湿润,粘稠,易挑起放线菌:干燥,多皱,难挑起,菌落较小,多有色素酵母菌:湿润,粘稠,易挑起,表面光华,比细菌的菌落大而厚霉菌:菌丝细长,菌落疏松,成绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状,无固定大小,多有光泽,不易挑起细菌:一般形成较小的圆形菌落,颜色有白色、黄色等,表面光滑或不光滑放线菌:菌落背面有同心圆形纹路。这点可以和细菌菌落区分。酵母菌:菌落为淡黄色,光滑,半透明,比细菌菌落大。霉菌:菌落大型,肉眼可见许多毛状物,棕色、青色等,可见黑色的分生孢子群。转