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真蛋白如何检测?
[font=宋体][font=宋体]真核蛋白表达系统是一种广泛应用的蛋白表达方式,通常利用酵母、昆虫或哺乳动物细胞作为宿主。这种表达系统所生成的蛋白与目标[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]具有极高的相似性,能诱导高效蛋白表达。那么,在实施真核蛋白表达时,有哪些关键的纯化步骤呢?接下来,我们将详细解析这一过程。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]首先,我们要明确真核蛋白表达的纯化步骤是至关重要的环节。这些步骤不仅关系到最终产品的纯度和产量,还直接影响其生物活性和应用价值。因此,选择合适的纯化方法对于整个实验的成功至关重要。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]真核蛋白表达及纯化步骤主要有以下几个方面:[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、重组质粒构建:将目的基因克隆进表达载体,常见的方法包括限制性切酶切割,基因合成等,根据连接酶说明,进行线性载体和目的基因片段的酶联,最后对质粒测序做好验证;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、蛋白诱导表达:普适条件下查看蛋白是否表达,若不表达,更换载体,表达菌株等方法查看是否表达,如果表达,继续实验;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、蛋白表达部位分析:分析蛋白是可溶性还是不溶性的表达,即在超声后上清表达还是沉淀表达;是否与你的目标蛋白表达部位相同,相同进行后续蛋白表达条件优化;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、蛋白表达优化:优化诱导[/font][font=Calibri]IPTG[/font][font=宋体]浓度、诱导温度,进行放大培养;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、蛋白纯化:根据目标蛋白的性质进行样本处理,然后进行亲和纯化,获取目的蛋白。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]真核表达系统的选择与应用[/b][/font][font=宋体]酵母蛋白表达系统[/font][font=宋体]酵母真核蛋白表达系统有甲醇酵母表达系统,酿酒酵母表达系统,裂殖酵母表达系统以及克鲁维酸酵母表达系统等,其中最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,但现在运用最广泛的酵母表达系统还是甲醇酵母表达系统中的毕赤酵母真核蛋白表达系统。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]哺乳动物细胞表达系统[/font][font=宋体][font=宋体]哺乳动物细胞表达系统是真核表达系统中唯一可以表达复杂蛋白的系统,它能够指导真核表达蛋白进行正确折叠,提供复杂的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]型糖基化和准确的[/font][font=Calibri]O[/font][font=宋体]型糖基化等多种翻译后加工功能,所以它和昆虫酵母系统比较更具有发展潜力,哺乳动物细胞真核表达的蛋白与天然真核表达蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]但成本较高也一定程度上减缓了它的发展速度。哺乳动物细胞表达系统主要是通过改造宿主细胞来提高外源蛋白的表达效率,常用的宿主细胞有[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]COS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]BHK[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]SP2 /0N[/font][font=宋体]等,哺乳动物转染方法[/font][font=Calibri]*[/font][font=宋体]有脂质体转染法,电穿孔法以及病毒转染等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques][b]蛋白纯化技术[/b][/url]:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques[/font][/font][font=Calibri] [/font]
ps:在论坛上找了半天没找到适合这篇文章的地,暂且先放这吧。饲料中真蛋白的测定方法1.前言饲料作为畜牧养殖生产中的重要生产资料,其营养价值的高低直接影响到畜牧养殖的效益,而饲料中蛋白质的含量是一项重要的指标,饲料中粗蛋白质包括真蛋白质和非蛋白质两部分含氮物质,后者主要包括游离氨基酸、硝酸盐、铵盐等,故不能反映出饲料蛋白质对动物的真正营养价值。有些不法生产商故意添加硫酸铵、尿素等非蛋白质来提高产品的粗蛋白含量,导致部分养殖场户存在一个误区,认为标签上标注的粗蛋白质高,营养价值就高,从而造成养殖效益的低下。本文在凯氏定氮方法的基础上进行相应的前处理从而达到测定真蛋白的目的。蛋白质经沸水提取并在一定碱性条件下,能与硫酸铜发生盐析作用而析出沉淀,此沉淀物不溶于热水,而非蛋白氮则易溶于水,用热水洗沉淀,将水溶性含氮物洗去,剩下的沉淀物再用凯氏定氮法测定,得出真蛋白质的含量。2.实验部分2.1 仪器与试剂粉碎机、40目分样筛、分析天平(感量0.1mg)、烧杯250ml、玻璃棒、漏斗(直径10cm)、定性滤纸(中速,12.5cm,15cm)、可控温干燥箱、K1100F全自动凯氏定氮仪、SH420石墨消解炉、可控温电炉浓硫酸(98%)、硫酸铜(分析纯)、硫酸铜溶液(10%)、硫酸钾、氢氧化钠溶液(40%)、氢氧化钠溶液(2.5%)、硼酸(20g/L,按混合指示剂:硼酸=1:100加入指示剂)、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂[font=Times New Roman