血清培养基使用方法分析无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。 用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。添加组分1.促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。2.促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。3.酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。4.结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。5.微量元素：血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：1.处于对数生长中期2.>90% 活细胞率3.适应时以较高的起始细胞接种

植物组织RNA提取的难点及对策从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。要进行Northern杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库，RT-PCR及差示分析等分子生物学研究，都需要高质量的RNA。因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在。 a )*Y( W L 　　从文献报道上看，有许多植物就是由于未能有效地分离纯化其组织中的RNA， 而阻碍了其分子生物学方面研究的进展。一般认为在这些植物组织中，或富含酚类化合物，或富含多糖，或含有某些尚无法确定的次级代谢产物，或RNase的活性较高。在完整的细胞内这些物质在空间上与核酸是分离的，但当组织被研磨，细胞破碎后，这些物质就会与RNA相互作用。酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失［1］，或形成不溶性复合物［2］；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来［3］；萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解［2］和酶解。对于这些植物材料，用常规的RNA提取方法（如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等）难以提取出其RNA。如Lбpez-Gбmez等在用常规的方法提取芒果果实的RNA时未能成功，他们的结果分为三种情况：提出的RNA已被降解；RNA的得率很低；得到的RNA不能进行体外翻译。他们认为在果实成熟时各种酶的活性增强，其中也包含RNase，不溶性的淀粉转化为可溶性的多糖，芒果果实细胞壁中特殊的成份，以及果实中高含量的多酚化合物都是干扰RNA提取的因素［4］。Tesniere等在用苯酚法和胍法提取葡萄果实的RNA时，发现RNA与某种未知化合物凝聚成不溶性的复合物，并且这种未知化合物在230nm和270nm处有强的光吸收，从而干扰了RNA紫外吸收的测定［5］。因此能否有效地去除多糖、酚类化合物、RNase和干扰RNA提取的其它代谢产物是提取高质量植物RNA成败的关键。本文根据文献综述了解决上述植物RNA提取过程中难点的相应对策。 zL[=OZw^ 1　酚类化合物的干扰及对策 T G$GZ(N1 　　许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）［6］和树木类植物中［1］富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多［1］。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browning effect）［7］。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物［8］。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。 cHlu yS-fF 1.1　防止酚类化合物被氧化的方法 pU$IH*\| 2 　　还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸［9］来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2％［10］。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA时加入(-巯基乙醇（终浓度1％）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物［7］。 _K8] ) G, 　　螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去［6］。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低［11］。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用［6］。 \~/ )UyuSH 　　Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依靠氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂［4］。但如果Tris-硼酸浓度过高（＞0.2M）则会影响RNA的回收率［7］。 *59A zm K 　　牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性［6］。 -yR#,S _ 0 　　丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA［1］。 s4 q_ !qz 　　Guillemant等［12］和Ainsworth［13］认为低pH值（pH5.5）的提取缓冲液可以防止酚类化合物的离子化和进一步的氧化。 ; aX 0A t6 1.2　酚类化合物的去除 uQU)zmZZ3U 　　通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去［6］。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50％）来沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％ 2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理［14］。 } #Y ?W r 2　多糖的干扰及对策 R:Q=M F V 　　多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性［15］，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中［7］。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起［13］，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。 M qr-s9N 　　用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10％～30％，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10％以沉淀多糖［3］。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30％乙醇来沉淀多糖的，进一步纯化了RNA样品［5］。 l 1E 　　另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖［9］；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液［13］。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质［16］。在提取某些植物材料的RNA时，是将上述两种方法结合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质［4］。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合使用效果最佳［7］。 G>5 '8 　　Fang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖［15］。Chang等在提取松树RNA时，缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离［10］。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖［14］。 `0xoS54Vh 3　蛋白杂质的影响及对策 ' % #3 L 　　蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。 `W` *r0^Xj 　　Wilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70％高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于70％高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质［17］。 y Wv> g$ 4　次级代谢产物的影响及对策 'S|xat8NjL 　　从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等［18］综合Hughes等［16］的选择性沉淀法、Chirgwin［19］的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA。 MT^# t P;I 　　由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。P hS e%-a 　　随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。

独家收藏的细胞培养小技巧细胞培养的路上，有多虐心就有多少要注意的地方。大家擦干眼泪，听师姐几句话。希望我所说的能帮助你细胞培养的路上，少一点污染，多一点快乐。细胞方面1. 买细胞要去靠谱的地方买，比如 ATCC 官网或者丁香通。一般上面会有针对细胞的介绍，这样培养之前可以了解细胞正常生长的状态图、传代、培养基的类型等。2. 不管是买的细胞，还是别人惠赠的细胞，刚拿到手赶紧的做两件事：检测是否有支原体污染；迅速扩增冻存，冻存细胞复苏后第二天最好更换一次培养基。3. 发现细胞有污染迅速处理掉，特别是当你养了很多种细胞时。细菌污染、真菌污染很容易发现，支原体污染的话，细胞会长的慢，可以买个支原体检测的试剂盒定期检测一下。4. 不同细胞生长周期不同。有的生长很快，比如说 MDA-MB-231，传代的时候取离心悬液的十分之一就已经足够了。有的又是特别慢，比如 BT474，传代是一分二，复苏起始的时候两周多才能长满。这就需要要在培养细胞的过程中多多摸索。5. 对于娇弱的细胞，就得细心呵护。胰酶消化不能过久，吹得时候要轻柔，离心时候也要注意转速和时间。每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。记住，是每天。操作方面1. 最好不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。自己的东西自己包自己烘干。枪头什么的只要有可能污染就换。2. 严格无菌操作。操作台一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精消毒一遍，稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。3. 水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，记得要勤换。身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。培养箱隔一段时间彻底用酒精棉擦洗一次。4. 细胞房日常的值日清洁是必须的，此外还要定期熏蒸。晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。最好的是同一时间就你一个人在细胞房养细胞。5. 动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来。刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。

三种蛋白测定方法与标准曲线拟合一、蛋白浓度测定的常见方法1、考马斯亮蓝g250法测定蛋白浓度（bradford法）1）实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝g－250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm吸光度可测定蛋白质的含量。另外，反应体系中呈现的颜色变化主要是g-250分子间疏水相互作用形成的聚集体聚集程度不同引起的。单体形式表现为蓝色，单体和聚集体共存时表现为绿色，全为聚集体形式呈现为棕红色。影响因素主要为溶液体系中磷酸、乙醇、nacl的含量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5μl/ml时就有0.275光吸收值的变化，比lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100μg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10μg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。2）优缺点此方法干扰物少，研究表明：nacl，kcl，mgcl2，乙醇，（nh4）2so4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，edta及微量的去污剂如triton x-100，sds，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。3）试剂①考马斯亮蓝g250溶液：100mg考马斯亮蓝g250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% h3po4，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤即可。②标准蛋白溶液：纯的牛血清血蛋白(bsa)，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/l nacl配制成1mg/ml蛋白溶液。3）实验步骤①绘制标准曲线 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色。②未知样品蛋白质浓度测定取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的a595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。 2、bca法测量蛋白质浓度1）实验原理bca检测法是lowry测定法的一种改进方法。蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与cu2+络合生成络合物，同时将cu2+还原成cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。2）优缺点与lowery法相比，bca蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与bradford法相比，bca法的显著优点是不受去垢剂的影响。bca法蛋白质浓度检测范围为10-2000 μg/ml。检测0.5~10 μg/ml微量蛋白时应采用浓缩试剂，并需要在60oc反应。但bca法在样品含有脂类物质时将明显提高光吸收值。蛋白样品中edta或葡萄糖浓度大于10 mm不能使用bca方法。3）试剂①bca试剂的配制试剂a（1l）：分别称取10g bca (1%)，20g na2co3·h2o (2%)，1.6g na2c4h4o6·2h2o(0.16%)，4g naoh (0.4%) ，9.5g nahco3 (0.95) ，加水至1l，用naoh或固体nahco3调节ph值至11.25。试剂b（50ml）：取2g cuso4·5h2o (4%)，加蒸馏水至50ml。bca试剂：取50份试剂a与1份试剂b混合均匀。此试剂可稳定一周。②标准蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。4）实验步骤①绘制标准曲线（略）。②试剂加完后，混匀，于37℃保温30min，冷却至室温后，以0号管为对照，在562nm处比色。③未知样品蛋白质浓度测定 3、紫外吸收法1）实验原理大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大光吸收。当入射光、吸光系数和溶液的光径长度l不变时，这一波长范围内的吸光值与蛋白质浓度成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。2）优缺点此操作简便，测定迅速，低浓度盐类不干扰测定。但只适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，容易受到平行物质的干扰，如dna的干扰；此外，此方法敏感度较低，要求蛋白的浓度较高（0.1-0.5mg/ml）。且玻璃器皿会吸收紫外线，需要石英等特殊材料器具。3）试剂①标准蛋白质溶液：精确配制2mg/ml的酪蛋白溶液。②样品溶液4）实验步骤①绘制标准曲线（略）②测定未知样品溶液5）结果分析根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。此外，紫外吸收法也可以不制作标准曲线，直接测280nm的od值，然后通过od值与校正系数直接求得未知蛋白的浓度。上述三种方法在测定吸光值时，既可以使用紫外分光光度仪、酶标仪，甚至也可以使用nanodrop微量计。它们所需要的样品量逐渐减少，所以制作标曲时不同仪器加入的试剂量也不尽相同，需要具体分析。 二、利用excel软件拟合标准曲线1、将标准蛋白测得的od值及对应的浓度输入excel表格中，并求出重复测量的平均值。2、将0ug/ml对照管的od值减去，进行背景校正。3、将标准浓度和对应的校正值转变为列。（复制，选择性黏贴，转置）4、选中校正值和浓度的数值，然后找到excel工具栏“插入”，在下拉窗口中选择“散点图”图标，并选择不带曲线的散点图。5、在弹出的“标准曲线”图中，找到任意一个“散点”，右击该点，在弹出的菜单中选择“添加趋势线”。6、接着会弹出一个参数选择窗口，在该窗口中选择“线性”趋势线，并勾选”显示公式“、”显示r平方值“。7、不同的excel版本，略微有些区别，选定参数后，点击“确定“。即可得到完整的标准曲线。一般r平方值≥0.99，即说明该拟合曲线可以使用。8、将测得的未知蛋白od值代入标准曲线公式”y = 1316.5x – 3.6272“中，即可求得未知蛋白的浓度。

ChIP 抗体选择指南！单克隆抗体 vs 多克隆抗体 单克隆或多克隆抗体都可用于ChIP。由于单克隆抗体识别靶蛋白上的单一表位，因此它们通常提供高水平的特异性，低非特异性结合和低背景信号。此外，由于克隆性质的低变异性，单克隆抗体通常在批次之间更一致。 然而，如果由于存在其它染色质相关蛋白，可能导致被单克隆识别的表位是不可接近的或需要识别的表位被ChIP方案中的步骤掩蔽（例如交联），则单克隆不会有效地结合蛋白。幸运的是掩蔽不常见，因此单克隆适用于ChIP，可以产生出色的结果。 与单克隆抗体相比，多克隆抗体通常识别靶蛋白上的多个表位，并且即使通过交联掩蔽少数表位，也可以更有效地检测靶标。然而，因为多克隆识别多个表位，这可能会增加发生非特异性结合的可能性。 此外，多克隆抗体的特异性可能漂移，除非在制备或纯化之前汇集抗体衍生的血清。为了减轻这些挑战，一些抗体制造商对多种动物进行免疫，然后筛选和汇集血清，证明适当的亲和性和特异性。为了确保一致性，可以将最终抗体的性能与以前的批次进行比较。 考虑其他免疫测定的性能数据 并不是所有的抗体都具有显示ChIP性能的数据，但并不总是表明它们在ChIP中不起作用。为了节省筛选多个候选抗体的时间，考虑来自其他免疫测定的数据，可作为抗体在ChIP中工作良好的可能性的指标。蛋白印迹和免疫沉淀测定将告诉您抗体是否识别正确的靶标；免疫荧光分析将帮助您确定抗体是否识别其天然状态的靶标，这对ChIP很重要。 在多种应用如免疫沉淀，免疫荧光或免疫组织化学中验证的抗体，比仅通过Western印迹验证的抗体更有可能产生阳性ChIP结果。当然，这些应用中的性能并不能保证ChIP的成功，因为成功的ChIP抗体必须识别可接近的抗原表位，这些表位不应该受ChIP通常使用的交联方法的影响。 想知道一支抗体的ChIP数据是否可用，可考虑以下问题。1.得到该数据使用的抗体批次是否与你购买的批次相同？2.有没有人使用这种抗体进行ChIP？3.有没有已知的用于验证浓缩的阴性IgG对照和阳性对照引物组？ 验证抗体特异性 在最终确定抗体选择和进行实验之前，评估抗体的特异性很重要。组蛋白抗体尤其如此。 此外，很多杂志越来越要求将组蛋白抗体特异性表现作为文章发表的条件，因此进行独立筛选测定以检测潜在的交叉反应性是重要的。可以通过以下测定评估抗体的特异性：Peptide Dot Blots，Peptide Inhibition Assays，Peptide Microarrays，Peptide interaction assays。 ChIP抗体选择要点总结：单克隆抗体和多克隆抗体都可以应用于ChIP实验；理想的ChIP抗体是经过ChIP验证；在多种免疫测定（如IP或IHC）中验证的抗体比仅在Western印迹中验证的抗体值得信赖的应用于ChIP实验；进行独立的特异性筛选。

天狼星红染色没染上操作的步骤是：（1）石蜡切片厚5?m，脱蜡至水。（2） 入天青石蓝液10min。（3） 蒸馏水冲洗3次。（4） 天狼星红饱和苦味酸液30min；（5） Harris苏木素液淡染细胞核1min。（6） 自来水稍微冲洗掉染液后，直接用无水乙醇分化与脱水3min。（7） 二甲苯透明、光学树胶封固。

FRET 能否检测两种蛋白的亲和性是强还是弱？以cfp-yfp为例能量转移以后会引起yfp发黄色荧光。那么可否根据荧光强度的强弱（能量转移的多少）来进行判断呢，比如C-CFP引起的A-yfp的黄色荧光要远强于引起的b-YFP，是否就认为是C与A的结合要强于C与B的结合呢，或者说C与A之间的距离要小于C与B之间的距离呢。我正找理论支持，目前还没有找到。

elisa酶标板分类与性能判断酶标板作为elisa检测实验中的辅材，起着举足轻重的作用并直接影响最终实验结果，酶标板的好坏主要取决于其对蛋白吸附的灵敏度、板孔间蛋白吸附能力差异以及所采购酶标板批次间的差异。因此，选择一款蛋白吸附灵敏度高、对蛋白吸附能力孔间差异小、批次间差异小的酶标板产品，是实验者获得可靠、稳定实验结果的保障。酶标板分类：根据不同的分类标准，酶标板有着不同的分类。一、根据孔数，可分为96孔、48孔等，由于酶标板主要是配合酶标仪用，目前市面上的酶标仪最多为96孔，因此酶标板最为常用的也是96孔。二、根据其底部的不同，又分为平底的，u型底、v型底等。平底的折射率低，适于在酶标仪检测；u型底的酶标板折射率较高，方便加样、吸样、混匀等操作，可以不用放在酶标仪上，直接通过目测观察颜色变化情况，从而判定有无相应的免疫反应。v底的酶标板可以精确的吸取样品。三、根据酶标板与蛋白和其它分子结合能力的不同，又分为高结合力、中结合力和氨基化等。1） 高结合力此种酶标板，表面经处理后，其蛋白结合能力大大增强，可达300~400ng igg/cm2，主要结合的蛋白分子量＞10kd。使用该类酶标板可提高敏感性，并可相对减少包被蛋白的浓度和用量，不足之处为较易产生非特异性反应。抗原或抗体包被后，以非离子去污剂无法有效地封闭未结合蛋白的部位，需使用蛋白作为封闭剂。（2) 中结合力此类酶标板经表面疏水键被动与蛋白结合，适合作为分子量＞20kd的大分子蛋白的固相载体，其蛋白结合能力为200~300ng igg/cm2。由于该类酶标板所具有的仅与大分子结合的特性，适用于作为未纯化抗体或抗原的固相载体，可降低潜在的非特异性交叉反应。该类板可以惰性蛋白或非离子去污剂作为封闭液。（3)氨基化这种酶标板经表面改性处理后拥有带正电荷的氨基，其疏水键由亲水键取代。该类酶标板适合作为小分子蛋白的固相载体。使用合适的缓冲液和ph值，其表面可通过离子键与带负电荷的小分子结合。由于其表面的亲水特性和可通过其它交联剂共价结合的能力，可用于固定溶于triton-100、tween 20等去污剂的蛋白分子。该类板的缺陷为由于降低了疏水性，一部分蛋白分子无法结合；此外，其表面需有效地封闭。由于亲水和共价的表面特性，使用的封闭液必须能够与非反应性氨基基团和所选择的交联剂中任何功能基团发生作用。四、根据颜色可分为透明、黑色、白色。透明的是最常用的，用于最一般的酶联免疫实验。相对于透明的的酶标板，还有用于发光检测用的不透明的酶标板，一般有黑色和白色两种。黑色的酶标板自身会有光吸收，所以它的信号相对于白色酶标板要低很多，因此一般用于检测较强的光，如荧光检测。而白色的酶标板就用于较弱的光检测，常用于一般的化学发光。另外黑色的酶标板还可以消弱非特异反应带来的问题。同时需要注意的是，用一般的酶标板不可以进行发光检测，因为一般从化学发光反应中发射出的光是各向同性，如果用透明的酶标板，光不仅会从垂直方向发散，还会从水平方向发散，使得光极易通过各个孔之间的间隙和孔壁，从而导致各孔的光吸收值受到相邻孔发射光的影响。酶标板性能判断良好的酶标板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。酶标板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的酶标板在使用前须事先检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人igg（一般为10ng/ml）包被elisa板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人igg抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%。以下以a、b、c三款酶标板为例。直接法：检测human igg在酶标板表面的吸附 双抗体夹心法：包被山羊抗人抗体检测阳性血清中抗原 由上图可以看出，这三类酶标板中，a类酶标板具有更好的蛋白吸附效果，同时也提高蛋白吸附的灵敏度，能够提供更为可靠的实验数据。另外，可以询问酶标板的批内差异，以下是某款酶标板的批内差异。由批内差异数据图可以看出，该酶标板具有很好地批间稳定性，批内变异系数（cv）差异均在5.0％附近，明显低于业内关于临床免疫反应用酶标板的质量控制标准中批内变异系数低于10.0%的要求，因此也适合用于elisa实验。

elisa实验18条通用规则elisa实验操作所要求的条件是比较严格的，无论是对实验的硬件条件还是对实验的操作人员的技术要求，都是如此。下面所提到的就是一些在进行elisa实验时所要注意的一些问题。elisa实验18条通用规则1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。可用水和电子天平进行确定。但最好有专业人员进行矫正。2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。4、实验时，要使底物避光保存。5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。8、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。也可以用酶标仪的晃动功能。9、温浴时，要用不干胶或胶带纸封好酶标板，防止水分的蒸发。10、洗板时，每次洗液加入后，应静置1分钟，使清洗更加彻底。没有洗板机时，倒去液体后，要将酶标板在报纸或毛纸上用力拍干。11、洗液不够时，可用蒸馏水自行配制ph7.4，0.02m的磷酸缓冲液，加入0.1%的吐温20作为洗液。加入1/1000的叠氮钠后可长期保存。12、底物是光敏感的，要在临用前现配。13、检测前，要打开酶标仪，使之稳定10分钟以上。14、底物有一定的毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，应尽量避免接触。15、待检样品要澄清，否则会影响结果。16、温浴时间应遵守试剂盒规定。17、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。18、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。

 各新老用户，公司各部门： 　根据《国务院办公厅关于2017年端午节放假安排通知》并结合公司的实际情况，经公司领导研究决定，2017年端午节放假安排如下：端午节放假时间为:5月28日至30日放假调休，共3天。5月27日(星期六)上班。端午节将至，希望大家能提前安排好行程，回家或外出旅游路途都能注意安全，提前预祝公司全体员工及各新老用户节日愉快，阖家欢乐!　　　                                                               特此通知                                                      上海康朗生物科技有限公司　　                                                           2017年5月26日

看得见的蛋白互作新技术duolink pla现今，科技发展的齿轮正在高速运转，每隔2-3年就会出现一个重大的技术变革引领生命科学走向更精细、更微观、更真实的水平，这其中也包括蛋白的研究。在疾病的致病机理、分子机制、信号通路、药物筛选以及新型诊断标志物的发现中，传统的蛋白研究“金标准”方法如co-ip、western blot、elisa、if等已呈现出很大的局限性。  你可能在实验中遇到过以下问题：wb方法灵敏度较低，无法检测低丰度、瞬时表达的蛋白；co-ip方法无法检测蛋白之间的微弱相互作用及间接相互作用；蛋白过表达或融合标签后会改变其原有的功能，造成假阳性等结果；非内源性表达，无法反应真实的状态，结果无说服力；……这表示，你目前使用的蛋白检测方法已无法满足研究所需的技术要求，是时候跟上蛋白研究技术变革的脚步，找到合适的新方法！看得见的蛋白互作新技术duolink® pla®加速了蛋白研究新发现。该技术可将蛋白信号放大1000倍，实现单分子级别的灵敏度。即便是微量样本、微弱互作、极罕见的低丰度表达，也能在内源水平可视化研究蛋白的互作、定位和定量。更关键的是该技术操作简单，仅需一天！duolink® pla® 技术至今已在肿瘤学、神经生物学、免疫学、病毒学、表观遗传学、生殖发育、组织病理学、心血管、代谢等研究领域进行了广泛报道。下面针对不同方面的应用实例进行简单分享。应用1：蛋白瞬时相互作用检测，解决co-ip技术无法实现的应用在肿瘤学研究过程中，很多蛋白的相互作用过程并不是稳定的，而是动态变化和瞬时产生的，下图是一篇肿瘤血管生成的研究，显示vegf刺激前后的不同时间，duolink pla技术能够原位检测内皮细胞中ve-ptp与vegfr2复合物的相互作用，每一个红点代表一个相互作用的复合物，蓝色代表细胞核。作者通过pla技术发现vegf以瞬时作用方式调控ve-ptp和vegfr2复合物的形成，文章显示用传统的co-ip方法无法检测ve-ptp与vegfr2的相互作用。此外，由于pla是细胞内源性水平检测，因此这种相互作用结果更加真实，作者也通过pla技术发现了ve-ptp在血管生成中具有重要的功能。应用2：微量细胞中的微弱蛋白互作检测，解决co-ip技术无法实现的应用在神经生物学研究中，很多时候研究的起始材料包括细胞、组织等非常微量，同时相互作用的蛋白也很微弱，超出了传统方法如co-ip的检测灵敏度。dyx1c1是阅读障碍的易感基因，与神经元迁移有关，但并不清楚他们之间的功能与相关性。下图显示原代大鼠胚胎海马神经元使用雌二醇培养48h，pla检测雌激素受体ers/dyx1c1在神经突触中的相互作用（a，d为雌二醇（e2）刺激组，b,e 为未刺激组，c，f为无抗体阴性对照），每一个红点代表 ers/dyx1c1相互作用的复合物，蓝色代表 hoechst 染细胞核，绿色代表actin蛋白。作者使用传统co-ip方法并没有在胚胎神经元中检测到相互作用的复合物。通过pla技术，对dyx1c1的功能有新的理解，发现了神经元迁移、阅读障碍与雌性激素信号通路的联系，从而影响脑发育，调节认知功能。 应用3：病理组织中蛋白相互作用的原位检测，解决ihc无法实现的应用在肿瘤的靶向治疗过程中，braf是非常重要的药物靶点，很多肿瘤都存在braf(v600)的突变，很多药物都是针对这个位点，但是逐渐增加的药物抗性让大家迫切希望能够进一步发现新的药物靶标，和传统药物联合治疗，进一步提高药物治疗效果。下图是发表在nature上的文章，从药物产生抗性的机理出发，针对抗性相关的信号通路中共同的复合物eif4f，开发了pla原位技术在细胞以及临床的病人病理组织样本进行大量的检测。下图显示与anti-braf治疗前的肿瘤相比，eif4f复合物的形成比率在免疫应答的肿瘤中降低，在抗药性转移的肿瘤中复合物形成比率升高，图中每个棕色的点状信号代表一个相互作用复合体。因此eif4f 能够作为先天（innate）和获得性（acquired）抗性的指示器，也能作为抗肿瘤治疗的靶标，通过封闭eif4e–eif4g相互作用或靶向 eif4a，能够抑制eif4f复合物的形成，从而协同抑制braf(v600)，消除肿瘤细胞。pla技术作为病理组织学研究的第二代新技术，在蛋白相互作用研究中具有高分辨率及精确性，是传统ihc实验无法实现的，能够建立高质量的病样组织标本库。 应用4．可视化检测蛋白相互作用与翻译后修饰，解决if技术无法实现的应用在很多相互作用和蛋白修饰的研究中，我们不仅希望发现两种蛋白的相互作用或是蛋白的翻译后修饰，我们更希望能够观察到这种相互作用，对这种相互作用准确定量。下图文章是将pla技术与流式技术结合，通过蛋白之间的相互作用及翻译后修饰研究，为肿瘤提供新的预后标志物。下图显示pla技术结合流式，能够在不同类型细胞中对egfr与her2 的同源和异源二聚体的相互作用进行定量检测，然而if与流式结合无法对二聚体进行准确定量。此外，细胞在egf刺激后，二聚化模式和磷酸化状态发生了变化，egfr和her2在不同细胞系有很大不同，pla能够对egfr的激活进行可视化研究，但if无法观察到egfr的激活，图中红色为pla检测的磷酸化的 egfr 蛋白。因此pla技术与fcm的结合能在单细胞水平为蛋白相互作用和翻译后修饰提供更为强大的方法，能够为恶性肿瘤的治疗提供预后靶标。 应用5．单细胞水平检测组蛋白的修饰进行分析，解决chip研究中无法实现结果的应用表观遗传学是当前一大研究热点，而chip又是表观遗传学中最重要的技术之一，它能帮助研究者很好地理解组蛋白修饰在基因调控中的作用，但chip无法应用于单细胞水平。下图这篇发表在nature上的文章，将pla技术与原位杂交（ish）技术联合起来开发出新的ish-pla技术，可在石蜡切片的组织样本中，对特定类型单细胞中的特定基因位点的组蛋白修饰进行可视化研究。图中箭头表示在人颈动脉和脑组织中的组蛋白修饰的pla信号。研究发现在人和小鼠的组织中myh11位点的h3k4me2被限制在平滑肌细胞中，ish-pla 能准确、特异性地检测人和小鼠组织中单个细胞的特定基因位点的组蛋白修饰。该研究第一次在复杂的多种类型细胞存在的完整组织样本中，在内源性水平鉴定了特定细胞和基因位点的组蛋白修饰，显示在体内smc细胞中myh11基因h3k4me2独特和重要的表观特征，表明pla技术可以很方便地适用于单细胞水平组蛋白修饰和多个基因位点的检测。 应用6．高通量蛋白互作检测，药物筛选和靶标验证新方法药物研发过程中很大的一个障碍是很多临床前筛选的药物由于在临床使用中达不到预期效果或由于严重的副作用导致药物无法获得批准，占据了很高的研发费用。虽然高通量的化合物筛选能显著提高药物的筛选能力，但并没有获得很高的开发成功率。因此，急需一种方法能够鉴定生物学相关复合物，在药物研发早期能更精确地预测体内效应。下图文章基于药物在信号通路中的效应开发了高通量的pla筛选技术，通过前期鉴定的激酶抑制剂文库进行高通量筛选。通过对 pla技术筛选在激活的原代人成纤维细胞中能够抑制pdgf受体信号通路的复合物，在80个复合物文库中发现13个能够作为潜在候选（hits），这些复合物的剂量效应检测显示具有很高的z’ factor(0.71)和信噪比(11.7)，具有很高的抑制特定信号通路的能力。与磷酸化pdgf受体的免疫荧光(if)检测进行比较，显示出pla对受体磷酸化抑制效果的检测具有更高的检测效率。pla药物高通量的细胞内原位检测，能对抑制剂诱导的pdgf信号通路中蛋白相互作用进行准确定量，结果更真实，筛选效率更高。 如需了解duolink pla技术的原理和背景，以及更多应用和高分文章分享，请点击这里

分类介绍蛋白markerde 原理及作用蛋白质marker指的是做western时,用来参照的标准蛋白,显示蛋白大小,用以与自己蛋白进行对比,估计蛋白大小。在免疫印迹（Western blot）试验中，分子量Marker虽不起眼，但意义重大，是阳性对照，是大小的标准，是必须的。蛋白marker的分类：一. 未染色(pre mixed)蛋白分子量标准未染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。现在的marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条!数到眼都花了。所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。如果你的蛋白不幸在两条跨度较大Marker条带之间，选别的Marker吧。预混的Marker使用上不如预染Marker(pre-stained)好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才“开蛊”，无法对实验起预示参照作用。完全属于“后知后觉”型的，当然还是比“不知不觉”不做对照的要好。① 宽分子量蛋白标准如果从实验室总体考虑的，就选范围尽量宽，条带分布比较均匀的，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断，避免正好落在一段空白区的危险。不过条带越多，每次上样量也就越费。拿到Marker后，如果买的是大包装，就应该考虑分装。多次反复冻融对于蛋白的危险，不用多说吧。另外要记得，宽谱的Marker不一定每条都能看到的，特别是Mini Cell。如果侧重大蛋白，那小的可能就已经跑掉了，不是质量不好哦。② 高分子量蛋白标准通常在检测大分子量蛋白经常使用到高分子量蛋白标准，③ 低分子量蛋白marker标准在一般的蛋白电泳当中，更常用的是低蛋白标准分子量，除了有指示蛋白大小的作用以外，有时还可以用作粗略的定量。实验室用在一般蛋白电泳的低分子量蛋白标准中。在低分子量蛋白标准这里还包括可特别小的蛋白标准，比如30kD以下蛋白或者多肽的分离辨别。其中GE的从2kD到16kD之间有6条带的蛋白标准挺不错，另外提醒一句，特别小的蛋白Marker条带如果要显色好，上样一定要上足够的量哦。二.预染蛋白分子量标准预染蛋白分子量是一些纯化好的蛋白混合物，通过与染料共价耦联，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到。预染蛋白分子量的出现方便了我们的实验，这种蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率——比如，已知垂直电泳最佳分辨区域大约在胶的2/3处，如果使用预染Marker就可以预测目标蛋白进入最佳分辨区时停止电泳以得到最佳分辨效果;如果观察到Marker电泳异常也可以及时终止电泳;另外在Western Blot转膜以后可以直接观察蛋白转膜是否完全，还可以在膜上标记蛋白分子量，所以吸引了许多实验室人员购买预染蛋白标准。值得注意的是预染蛋白Marker与染料共价耦联，所以在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发生某些变化，可能导致一些偏差，所以不太适合精确定位蛋白——不过多数情况下Marker的条带未必能和我们的目标蛋白完全一样，我们得到的也不过是一种相对Marker指示的参考大小，最后都需要Western来定性，所以如果不是要区分大小相近的条带，预染Marker还是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白标准一起使用。预染蛋白标准可以分为两种：单色预染和多色预染，其实区别就在于帮助在实验过程中辨认某个条带的大小——Marker条带越多参考价值越大，可就越难辨认区分，如果用不同的颜色来区别就比较好辨认啦。如果沉闷的电泳实验中跑出五颜六色的彩虹Marker，此时心情想必会愉快一些!单色的Marker通常是利用其中某些条带加倍浓度来提示其大小的。还有一点特别要注意，由于转膜是一个将胶里的Marker浓缩在洁白的膜上，所以需要的上样量相对少一些，如果想要在电泳过程中看到美丽的“彩虹”，或者单色的Marker往往需要比说明书里多加一些Marker的。三、Western专用的蛋白分子量标准①生物素标记蛋白标准未染色的Marker在做Western时，需要在印迹前先用丽春红或者是SYPRO荧光蛋白染色液等不干扰Western Blot的染色方法显色，在胶上做标记最后才能“拼”在最后的结果中，如果是预染的Marker就要在转膜后标记膜，或者剪膜，最后在“拼上”。要是想直接将Marker结果显示在最后结果上，不用手工作图或者拼接，那就要Western专用的Marker了。比如生物素标记的蛋白标准。这种方法主要是配合化学发光法：在蛋白分子量上标记生物素，通过带有抗生物素的抗体或者偶联链亲霉素的抗体，在化学发光检测到目的蛋白带时就可以同时看到相应的分子量标准一起发光显影了。不同于普通蛋白分子量标准的便宜、预染蛋白分子量的方便，这一方法的优点是与Marker和目的蛋白对应性好，同时在同张片上显示，不用拼接，利于分析。缺点是如果样品中带有生物素背景，那个抗生物素抗体有可能影响结果，而且反应体系太过复杂也会干扰实验结果。②特殊标记蛋白标准在经过修饰的蛋白标准中，除了生物素标记以外，近些年由于下游蛋白操作的丰富化与复杂化，也出现带有“尾巴”的蛋白标准。比如His-Tag，如果每个Marker条带都有His –tag，那二抗添加His-Taq抗体很容易将Marker条带显示在Western结果上。很方便，问题就是有可能有潜在的干扰，比如样品中正好有类似Histag的结构。不过这可以通过对照检测的。

LB肉汤的用途及注意事项LB肉汤是一种培养基的名称，应用在微生物培养方面越来越广泛，常用于生化分子试验中，用该培养基来预培养菌种，使菌种成倍扩增，达到使用要求。培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌。LB肉汤贮存方法：培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在2~10℃的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管，现在均改制成粉末。LB肉汤用途分类：运送培养基：在取样后和实验室样品处理前保护和维持微生物活性的培养基。保藏培养基：用于在一定期限性内保护和维持微生物活性，防止长期保存对微生物不利影响或使微生物长期保存后容易复苏的培养基，如菌种保存培养基等；复苏培养基：能够使受损或应激的微生物修复，使微生物恢复正常生长能力，但不一定促进微生物繁殖的培养基，如蛋白胨水等；增菌培养基：大多为液体培养基，为微生物提供特定的生长环境，如营养肉汤、TSB等选择性增菌培养基：能够保证特定微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其它微生物生长的培养基。非选择性增菌培养基：能够保证大多数微生物生长的培养基，如胰酪大豆胨肉汤等；选择性分离培养基：支持特定微生物生长，而部分或全部抑制其它微生物生长的培养基。鉴别培养基：能够进行一项或多项微生物生理生化特征鉴定的培养基，如木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂、三糖铁琼脂培养基等；鉴定培养基：能够产生一个特定的鉴定反应而不需要做进一步确认试验的培养基，如兔血浆、生化鉴定系统等；多用途培养基：同时可归为多种不同用途的特定培养基，如血琼脂，可为一种复苏培养基，也可为分离培养基，也可为鉴别培养基(溶血试验)。

细胞转染操作方法转染 ，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。一、细胞传代1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟(37℃，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。9. 将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。二、细胞转染1. 转染试剂的准备① 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。② 震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。2. 选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。3. 将混合液在室温放置10―15分钟。4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

DNA ladder法检测细胞凋亡发生细胞凋亡时，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNA ladder）。一、材料与试剂凋亡细胞；蛋白酶K（500μg/ml）8mol/L 醋酸钾白细胞裂解液：pH8.0，10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1% SDS。氯仿无水乙醇，70%乙醇；2%琼脂糖凝胶。二、操作步骤1. 收集凋亡细胞：取1～2×106 个细胞，离心后，立即用70%酒精（-20℃）固定2h；2. 洗涤：取出酒精固定的细胞，1000r/min离心5min ，去掉上清液，PBS洗二次；3. 裂解细胞：加400μl细胞裂解液，充分混匀再加蛋白酶K100μl，置65℃水浴消化2小时或过夜；4. 蛋白处理：加75μl 8mol/L的醋酸钾，4℃15min，再加750μl氯仿，充分混匀后，10000r/min离心10分钟后，将上清移至一新的Eppendorf管中；5. 沉淀DNA：加入750μl无水乙醇，上下轻柔颠倒混合，即可见乳白色沉淀，若不明显时可置-20℃过夜，12000r/min离心10分钟，去上清；6. 洗涤DNA：加1ml70%乙醇，混匀，10000r/min 离心5min，去上清；7. 溶解DNA：根据 DAN 沉淀的大小，加一定量的蒸馏水或TE，37℃溶解；8. 测定DNA浓度；9. 2%琼脂糖凝胶电泳80V 2小时；三、结果判断出现梯状电泳条带，最小的条带为180～200 bp，其他的条带为其整倍数大小。坏死细胞则出现弥散的电泳条带，无清晰可见的条带。正常细胞DNA基因条带因分子量大，迁移距离短，故停留在加样孔附近。

固相包被技术介绍在许多固相免疫分析中，蛋白结合到塑料表面。通常是抗体结合，测抗原。结合抗原来测抗体。两种方法中，被固定的蛋白都被称为捕获蛋白。捕获蛋白直接结合到固相会引起结构的改变而降低免疫分析的亲和力。可通过二抗或亲和素等包被作为捕获蛋白。再结合一抗或经生物素修饰的蛋白。蛋白的结合率范围从5%到95%，所以整个包被过程的处理非常重要。低的结合率会浪费蛋白，而过量结合又会影响免疫分析。蛋白的结合是依靠分子的疏水作用。分子由于疏水作用被挤向塑料表面从而发生吸附。但分子蛋白的结合力较强。因为有更多的疏水位点，或是因为分子空间结构重新折叠从而暴露出更多的疏水位点而增加亲和力。如纤维蛋白，抗体等具有较高的亲和力。许多蛋白经糖基化，或在PH2-3溶液处理多可以改变极性或疏水位点以增加亲和力。通常在蛋白浓度10-100ug/ml时浓度越大包被速度越快。浓度过高固相上的蛋白就会发生相互作用，甚至发生聚集。塑料表面的弱酸性环境可以促使免疫球蛋白的Fc片断与塑料结合。PH强度，离子强度，温度等都会影响包被的过程，通常37度最为合适。另外时间也是个影响因素。部分蛋白在最初的几分钟内就能发生快速的结合，而剩下的则需几小时。蛋白结合的数量由蛋白的大小和塑料表面的范围决定。较为理想的结合每平方厘米能达到0.5-1ug的IgG。但是蛋白结合到塑料表面会改变其结构而降低免疫亲和力。蛋白在溶液中时其疏水位点在分子内部，当接近塑料表面是，疏水位垫被推向表面，与固相间的作用力由小变大。除了结构的改变，有的蛋白由于其活性位点在疏水位点附近因位阻作用而失活。由于以上原因，传统ELISA方法建立在抗体或抗原依靠吸附作用结合到聚苯乙烯固相上，他有几个缺点，包括：1，一致性差，2，温育时间长，3，洗涤过程中造成的分子分离导致不可重复性，4灵敏度低。相反，共价结合提高了灵敏度，降低了非特异结合而且消除了以上的缺点。Aleixo 等介绍了对苯环进行硝化处理在进一步使之氨化从而引入一个活性基团。氨基苯环容易发生化学反应如重氮化作用共价结合固定抗原。同样功能基团也可以通过嫁接或者气液技术得到。但是这些方法都很繁琐和耗时间。因此需要简单温和的方法使蛋白共价结合到微孔板上，这在诊断及相关领域都有很大的潜力。Nahar等发现了一种快速简单的方法就是利用FNAB（1-氟-2硝基-4-叠氮苯）的光化学反应。通过对聚苯乙烯微孔滴定板进行简单的光化学预处理提高了ELISA的速度和灵敏度。Epicoccum nigrum antigen（过敏抗原）或羊抗鼠在45分钟内在经过处理的微孔板上的吸收远远超过未经处理的表面。在ELISA分析中经过处理的板的计数是未经处理的1.5-2倍。而且经过处理的固相能够测出体积比1/50的溶液中的IgE。但1/5稀释后在经过处理的板上能测出的值是未经处理的板的3倍。这种表面的处理在酶联分析（尤其是对假阴性的判断）和方面分析中都很重要。

人外周血来源dc的培养心得我养树突状细胞一年多了，终于有点东西可以回馈丁香园带给我的帮助。第一：淋巴细胞分离液一定要好，进口的polymorphprep（axis-shield）很不错。这个分离液可出现白雾状的两层 上面的是单核细胞层下面的是多核粒细胞层，上面的就是含有我需要的dc前体细胞。第二离心力的问题：分离步骤450离心力 洗涤步骤400离心力。这个可以减少血小板。第三：关于细胞少的问题：经过我多次分离血，发现50毫升的外周血铺板一个6孔板，第六天就集中到两个孔中的细胞数量是2*106个细胞。dc前体细胞少，做实验的时候外周血一定不能太少。第四：贴壁情况：通常大家使用的是方法较简便的2小时贴壁后取出悬浮细胞，有必要指出，在2小时贴壁后，有很多细胞因为重力作用也在底部，一定要轻轻摇晃培养板，将沉在底部的非铁壁细胞摇起来吸除。一味的球细胞数量，只会降低细胞的纯度。培养到第三天以后 之前贴壁的细胞轻轻摇晃便会浮起来，也属正常。有时候贴壁有时候不贴壁，不要纠结是不是细胞死了，没有死，养就是了，这种半悬浮的状态dc常见。第五：细胞状态 细胞有增殖 三四天就会发现有细胞克隆团 十几二十个一个团 是养的好的标志 不要纠结要不要吹打开第六：细胞经lps刺激后的状态与刺激前的状态若要说有差别必须做流式检测表面分子最明显的是b7类的cd80 cd86。第七：换液丢失细胞的问题：这个问题困扰我很久，因为细胞半贴壁，吸走的情况实属正常，为了减少细胞的丢失，楼主最后迫不得已将换下来的液体放入灭菌15毫升离心管400g 20min离心 重新收集回来 再铺在原孔里 操作要仔细 污染的情况还是不多见的。第八：细胞不要经常拿出去（显微镜室温度较低）拍照，影响太大了，如果就在细胞房拍照还可以接受。第九：细胞因子是关键，这个不做赘述。大家都懂。第十：我上传的图片里，可以看出有的贴壁有的不贴壁 有单个散在的 有巨噬细胞（在红圈里的）大家观赏一下希望更多地人做dc希望更多的人可以指出文章中的不足，让大家学到更多的东西。

ELISA跳孔（Drift）跳孔的定义是酶标板从左侧到右侧的孔或从上到下的孔内信号出现显著的倒置现象我刚配置试剂的时候中断了，这是否会影响我的实验结果？◆ 这可能会导致产生波动的曲线。在移液之前确定所有的标准品或者样品是否配制完好。请在试剂配制完的15-20分钟内滴加入板内。（除非特别说明）我是否需要一个多道移液器？◆ 在配制诸如底物，酶结合物，或者稀释液的时候，最好选择连续或多道移液器。如果我没有平衡试剂会怎样？◆ 没有平衡的试剂会导致孔之间温度不均，使整个酶标板的信号产生变异。除非特别说明，试剂一般在使用之前都要平衡至室温。◆ 每次检测都会有推荐的孵育时间和温度。冷冻的试剂一般需要更长的孵育时间。所以最好使用说明书上推荐的孵育温度和时间。我是否需要盖板？◆ 参看试剂盒内说明书。如果说明书内的实验步骤中有推荐使用盖板，则在使用时应选用与酶标板配套的盖板，使边缘与酶标板紧密契合。如果盖板的一边突起，则会产生信号的差别。酶标仪的设置怎样影响我的结果？◆ 对于底物测定，如果读数时间等于或超过2秒/孔，使从第一孔到最后一孔在读书时存在时间上的延误，会导致结果的异变。在底物反应阶段，辣根过氧化物酶会一直作用直到底物反应完全。而由于时间的延误，底物越来越少，底物反应也受到影响。将酶标仪的读数时间设定为1.0秒/孔。我是否可以根据自己的方案来调整孵育时间？◆ 更改孵育时间或温度会导致检测不能达到平衡或过度反应。请按照说明书推荐的孵育时间和温度操作。◆ 如果同时进行多项检测，对每孔必需分别计时已避免孵育不足或过度孵育。

ELISA边缘效应（Edge Effect） 边缘效应的定义是酶标板孔内中心部分与酶标板孔内远离中心部分之间相比存在明显的信号差异，一般归因于两个主要因素。孵育环境确实对实验有影响吗？◆ 是的。孵育时温度不均会引起边缘效应。请严格按照推荐的温度进行孵育。如果条件允许，可以在能够控温的孵育器中进行孵育。◆ 在使用之前将所有试剂平衡至室温。（除非特别说明）◆ 在实验开始之前检查工作的环境温度。如果曲线很平直，可能是由于工作环境温度低于气温所致。在孵育末期我注意到盖板一侧突起来了，这是否会影响我的实验结果？◆ 盖板如果使用不恰当会导致边缘效应。

小鼠脑缺血再灌注损伤模型实验动物准备好之后，即可开始进行MCAO手术操作流程：1.术前准备：3%戊巴比妥钠麻醉小鼠，头部备皮，消毒，插入肛温探头，保持体温在37±0.5℃。2.MCAO造模：剪开颈部皮肤，分离出颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。在左侧颈总动脉上剪口，将一根头端处理过的0.18mm线栓经颈总动脉插入颈内动脉，直至大脑中动脉，深度至颈内外动脉分叉处约9±1mm，稍有阻力感即停止进线。缺血后1h拔掉线栓，缝合皮肤，将小鼠放在加热垫上，待清醒后放入恒温抚养箱饲养。整个过程必须维持小鼠的肛温在 37±0.5℃。3.术后24h，麻醉小鼠，分别取大脑进行后续实验。建模完成后，我们可以得到阴性对照小鼠（A组）和MCAO模型小鼠（B组）在术后24h TTC染色结果图。

 tim-3介导细胞免疫耐受免疫耐受作为一把"双刃剑"，在自身免疫病和癌症发生过程中发挥着双重作用。科学家们在研究抗癌家族时发现了一个新成员—tim-3，当部分病人对pd-1抑制剂产生耐药性时，tim-3抑制剂就可以作为新型免疫治疗物发挥作用了。tim-3敢与pd-1试比高，它究竟是什么来头呢?tim-3（t cell immunoglobulin domain and mucin domain-3）全名 t淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3，是一类t细胞表面抑制性分子，可以引起癌症以及病毒感染过程中t细胞的死亡。哈佛大学医学院richard s. blumberg课题组在nature上发表的研究成果展现了tim-3 介导免疫耐受的现象。作者最初预测tim-3能够与t细胞表面与ceacam-1蛋白相互作用，并通过体外刺激实验证实了这一猜想，随后通过一系列遗传学与免疫学手段证明ceacam-1与tim-3联合作用会产生抑制t细胞对癌细胞的免疫反应，从而导致t细胞对各类疾病产生免疫耐受现象。tim-3最早是在2002年研究哮喘易感基因中的新基因家族时被发现的，最初被认为特异性表达在t细胞表面。人类的tim家族成员包括：tim-1、tim-3和tim-4，位于5号染色体5q33上，如图1所示，tim分子结构包括：免疫球蛋白n末端结构域、跨膜区和胞内区。 目前的研究表明，tim-3高表达于辅助型t细胞（th1细胞）和细胞毒性t细胞中（tc1细胞），通过产生抑制信号导致th1细胞和tc1细胞的凋亡。tim-3的配体是一种广泛表达的可溶分子——半乳凝素9（gal-9），其可与tim-3分子可变区的寡聚糖结合进而对th1驱动的免疫反应进行负调控。有研究报道tim-3高表达于人类神经胶质瘤（gbm）细胞，及用抗pd-1治疗产生耐药性的动物的t细胞中，在免疫耐受和清除凋亡细胞过程中发挥重要作用。图2即为目前研究的tim-3参与介导的细胞免疫耐受机制。 

ELISA 中常见问题及解决方法ELISA 试验以灵敏度较高、特异性较好的特点得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。我公司将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期提高试验质量。Elisa 试验操作中可能影响结果的原因及其相应的解决办法1 选择试剂 选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡至少 30 分钟。2 加样 可能原因：1）血清或血浆标本分离不好即进行加样；2）手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长 （特别是室内温度较高时）；3）加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。解决办法：1） 标本为血清：将血液先自然存放 1-2 小时后，再用 3000rmp 离心 15 分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合 5-10 次，放置一段时间后，3000rpm 离心 15 分钟；若在几天内检测，可放在 2-8℃ 冰箱中，若要贮存，则置于-20℃ 的低温冰箱内。2） 加样后及时放入孵箱。3） 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。4） 如果采用 AT 或其他全自动加样，最好选择 FAME 或其他后处理仪器加酶试剂。5） 标本较多时，请分批操作。3 孵育可能原因：1） 孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；2） 孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。解决办法：1） 贴封片或加盖；2） 按说明步骤严格控制操作时间。4 洗板 可能原因：1） 采用手工洗板， 孔与孔之间液体交叉。2） 采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。3） 反应板过多造成洗板等待时间长。解决办法：1） 保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干；2） 合理安排，或多用几台洗板机。5 显色 可能原因：1） 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；2） 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。解决办法：1） 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的 TMB 显色剂不用；2） 加样时保持显色剂不外流；3） A、B 液应避免接触金属器械。6 终止 可能原因如加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。所以在加终止液时应避免产生气泡。7 读板 如读板时板底不清洁等。应保证酶标板清洁。在整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸；尽可能实现 ELISA 检测标准自动化，有效提高检测质量。在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时做好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。

基于抗体标记的病毒快速定量系统病毒既危害人类健康，但也可以作为一种工具（如病毒疫苗）治疗疾病，因此近年来对病毒的研究越来越受到重视。然而，科学家们遇到了不少挑战，其中最主要的就是一直缺乏实时的、在线的分析方法，用于以病毒为直接产物或者病毒为载体的蛋白表达系统的研发和生产中。 现在，我们找到了一种检测病毒的新方法，应用检测系统，只需要标记粗制或纯化后的样品，用 virus counter3100 6 min 即可获得高精度的病毒定量结果。 快速追踪生产体系中的病毒滴度的优势在于：*优化生产条件                    *提高产品得率*及时了解生产中的问题，避免损失  virocyt 通过技术创新，在数分钟内直接、特异性地进行病毒定量，远远胜于耗时、低精度的噬斑法、tcid50 等传统方法。利用荧光标记的高亲和力抗体，特异性识别目标病毒的特定抗原表位，既可以提高检测精度，也可以达到混合病毒中目的病毒鉴定的功能。 virus counter 3100 运用快速、免清洗标记程序进行病毒定量，so easy!  workflow:  吸取 5ul加入到含有 195ul 病毒液的样品管中，混合避光孵育 30 min，上机检测即可！！ 流感病毒检测 三种 flu-a 菌株通过 sdbbuffer 稀释后，使用invx 染色，最后通过3100 进行分析。结果发现，三种菌株可以保持非常好的线性相关性。  流感病毒的特异性检测 流感病毒 virotag(invx) 能特异性识别 flua，但不与腺病毒 3 和 5、杆状病毒等发生交联反应。  流感病毒可识别流感病毒 vlp 流感病毒（invx）同样能识别表达血球凝集素蛋白（ha）的类病毒样颗粒（vlp）。  腺病毒检测 腺病毒 virotag（advx）特异性识别腺病毒，且随着稀释倍数，呈现良好的线性关系。advx 完全不结合流感病毒和慢病毒，在病毒计数仪 3100 上检测结果低于检测下限 5x10e5 vp/ml。   杆状病毒检测 杆状病毒能特异性结合杆状病毒，通过病毒计数仪能对杆状病毒精确定量，且不受背景蛋白（3% 胎牛血清蛋白）的干扰。  可应用于生产的各个环节！  帮助您最大程度加速生产进程，提高病毒产量！更多信息，请联系我们。 联系电话：400-8816-128 产品信息： invx 试剂盒（catalog no.vt-0004-0001）包括所有需要的试剂和消耗品，可通过 virocyt 3100 检测 200 个样品：        flu a- and flu b-reactive label        sample dilution buffer (sdb)        inter-sample wash (isw)        cleanliness verification fluid (cvf)               performance validation standard (pvs)        startup/shutdown rinse(ssr)        sheath fluid        wash fluid        sample vials & caps                                      

2017清明节放假通知尊敬的各部门及客户们：清明节又叫踏青节，在仲春与暮春之交，也就是冬至后的第108天。是中国传统节日，也是最重要的祭祀节日之一，是踏青和祭祖扫墓的日子。　　根据国务院清明节的放假通知，结合我公司各项生产安排，兹定于2017年4月2日至4月4日共3天放假，于4月5日(星期三)正常上班，希望广大客户及员工朋友提前知悉，有订货需要的客户请及时与我们联系，以便节后尽快安排生产。计划外出游玩的朋友请提前安排好自己的时间，清明期间天气多变，请注意天气变化安全出行，外出游玩时请看好自己的行李物品。　　放假期间，我公司暂停一切生产发货安排，因此带来的不便敬请见谅，预祝大家过一个轻松愉快的清明节。　　                                                 上海康朗生物科技有限公司　　                                                       2017年4月1日

依照ELISA试剂盒说明书请求用处 ELISA试剂盒检查试剂每次实验、每块扳上都要设置以下3项对照和用处：1．空白对照：仅用稀释液替代检查样本、ELISA试剂盒用来观察终究反响的显色“本底"、ELISA试剂盒并用于酶标仪消除、扣减“本底"，也即是说：以本底为“零"读取阳性、阴性对照孔和样本检查孔的吸光值（A）；或许，在核算阴性对照均值（NCx）、阳性对照均值（PCx）、样本读数的S/C.O.值时减去空白对照的本底吸光值。前期的酶标仪没有主动扣减空白对照孔读数的功用，ELISA试剂盒这种酶标仪现在现已被筛选了，写上这段话的意图是弥补说明设置空白对照的用处。空白孔详细怎么读取读数，应当依照说明书操作。2．阴性对照：（1） ELISA试剂盒阴性对照的意义与请求：ELISA试剂盒所谓阴性对照，是本次检查实验中选用与待检查物（样品、人用试剂即是人的血清等）具有同源性和同质性，又不富含待检物质，而且可以客观比照和区分处理要素（血清免疫学实验中有特异性抗原与抗体反响）之间的区别。因而，用动物血清或其成品替代阴性人血清作为对照品，无论是从理论仍是实践上都是不可取的。留意：据我所知，国产ELISA试剂盒中，有的厂家是用动物血清成品稀释装备或与有些人血清混合装备的；阴性对照读数，并不是“越低越好"。NCx值挨近0.00X水平，这是假象！试想一下，真实选用“阴性人血清"的阴性对照品，NCx值会如此之低吗？例如，雅培乙肝六项ELISA试剂盒的NCx值，分别为：0.010（HBsAg）、0.027（抗—HBs）、0.035（HBeAg）、1.083（抗—HBe）、1.065（抗—HBc）、0.045（抗HBc-IgM）。生物梅里埃的HIV试剂NCx是0.091。区分试剂NCx值是不是合理的一个很简单的办法，只需比照大量阴性样本的实际读数就“一目了然"啦！（2）阴性对照分为两类 ELISA试剂盒一是受检人血清中并不富含或办法学灵敏度未能检出的待检物的基准水平，而且结果判断值（Cut off）核算式中决议“是"（阳性）、或“否"（阴性）的仅有可变值。阴性对照值高，致使假阴性；反之，ELISA试剂盒致使假阳性。二是阴性对照设置，在办法学上请求参加指示性定量规范品，ELISA试剂盒如中和剂HBeAg，定量HBcAg等，用以检查抗—HBe、抗—HBc。或许，选择代表平均水平的正常人血清用作阴性对照，ELISA试剂盒如检查抗—HBc IgM。此类Cut off 值核算时，大都均包含阴性和阳性对照值2个可变值。

ELISA试剂盒为什么会走近我们的生活 随着国家的开展，大家对科学范畴的探知也越来越深化，Elisa试剂盒即是生物范畴的一种产物。今日咱们就来看看为何ELISA试剂盒会越来越走近咱们的日子。ELISA试剂盒为何能走近咱们的日子，与其三大效果是分不开的。1. 酶和底物：在ELISA中最常用的酶为HRP和ALP。 2. 抗原  在ELISA中运用的抗原请求有较高的特异性、亲和力和纯度。主要有3类，即天然抗原、人工组成抗原和基因重组抗原。天然抗原的纯度不高，特异性不强；组成抗原通常为多肽片段，缺少天然抗原所具有的立体构造表位，亲和力不高，可能致使相应表位的抗体漏检；基因重组抗原具有安全、特异性强、亲和力高、产量大等特色，是一种对比抱负的抗原，但其纯化对比艰难。 3. 抗体  在ELISA中运用的抗体可分为多克隆抗体（多抗）和单克隆抗体（单抗）。多抗取白免疫动物的抗血清，制备较简略，但抗血清成分杂乱，除含对于抗原（多个表位）的抗体外，还含有多种其他抗体，亲和力和特异性相对要低于单抗，且制备周期长，批间差异较大。而单抗仅对于抗体的单一表位，亲和力和特异性均较多抗高，且制备技能老练，产量大，批间差异小，但联系位点的单一也恰是其缺点之地点，在双抗体夹心法中，如包被和指示抗体运用同一单抗，则因为联系位点的缺少，简单形成假阴．性结果。在运用双单抗一步法时，应留意抗原过剩时的“钩状效应"。以上即是ELISA试剂盒三大须知效果，将来ELISA试剂盒的开展是不行预知的，可是会对咱们的日子带来无限的好处。

ELISA加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1：40~1：200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

ELISA间接法测抗体    间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗　　体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。操作步骤如下：　　1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。　　2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗　　体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程　　中被洗去。　　3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗　　体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，　　固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。

人ELISA试剂盒的清洗方法清洁ELISA试剂盒自备资料:1.蒸馏水。2.加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。3.振荡器及磁力搅拌器等。人ELISA试剂盒操作注意事项：1.试剂应按标签阐明书贮存，运用前康复到室温。稀稀过后的标准品应丢掉，不行保留。2.试验中不必的板条应立即放回包装袋中，密封保留，防止变质。3.不必的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前运用。4.运用一次性的吸头防止穿插污染，汲取停止液和底物A、B液时，防止运用带金属有些的加样器。5.运用洁净的塑料容器装备洗刷液。运用前充沛混匀试剂盒里的各种成份及样品。6.洗刷酶标板时应充沛拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反响孔中吸水。7.底物A应蒸发，防止长期翻开盖子。底物B对光灵敏，防止长期露出于光下。防止用手触摸，有毒。试验完成后应立即读取OD值。8.加入试剂的次序应共同，以确保所有反响板孔温育的时刻相同。9.依照阐明书中标明的时刻、加液的量及次序进行温育操作。人ELISA试剂盒安全性：1.防止直触摸摸停止液和底物A、B。一旦触摸到这些液体，请赶快用水冲刷。2.试验中不要吃喝、抽烟或运用化妆品。3.不要用嘴汲取试剂盒里的任何成份。

ELISA试剂盒实验在操作中的好习惯ELISA试剂盒是平常一些小习惯就能够让您的实验在操作中变得与众不同，实验中的每个环节都很重要，忽略任何一个都可能导致实验的失败，每个人在实验中都有自己的一些好的细小的习惯，而有些好习惯能够让您的大鼠ELISA试剂盒实验一次就成功！ 技术员还建议ELISA试剂盒实验操作员养成这些好习惯： 1. 做完实验擦干桌子，一切东西归位，有些东西可以回收的就回收，很多实验室的枪头是回收的。 2. 实验前认真设计，作实验时不胡思乱想，做完后在认真分析试验数据。 3. 加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均。 4. 做实验一定要有计划，最好在有部分实验数据出来时，就着手写文章，这个不是为了出文章，而是在写文章的时候，可以清晰自己的思路，知道后面该先做什么，该重点做什么，不然有时候辛苦半死，数据太分散，不能说明问题。  5. 大鼠ELISA试剂盒不轻易用别人的东西，用时先打招呼，记录要详细，配液体时要记录试剂的批号等等。  6. 在实验中要记录：移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。