ELISA 中常见问题及解决方法

ELISA 试验以灵敏度较高、特异性较好的特点得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。我公司将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期提高试验质量。

Elisa 试验操作中可能影响结果的原因及其相应的解决办法

1 选择试剂 

选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡至少 30 分钟。

2 加样 

可能原因：

1）血清或血浆标本分离不好即进行加样；

2）手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长 （特别是室内温度较高时）；

3）加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。

解决办法：

1） 标本为血清：将血液先自然存放 1-2 小时后，再用 3000rmp 离心 15 分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合 5-10 次，放置一段时间后，3000rpm 离心 15 分钟；若在几天内检测，可放在 2-8℃ 冰箱中，若要贮存，则置于-20℃ 的低温冰箱内。

2） 加样后及时放入孵箱。

3） 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

4） 如果采用 AT 或其他全自动加样，最好选择 FAME 或其他后处理仪器加酶试剂。

5） 标本较多时，请分批操作。

3 孵育

可能原因：

1） 孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；

2） 孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。

解决办法：

1） 贴封片或加盖；

2） 按说明步骤严格控制操作时间。

4 洗板 

可能原因：

1） 采用手工洗板， 孔与孔之间液体交叉。

2） 采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。

3） 反应板过多造成洗板等待时间长。

解决办法：

1） 保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干；

2） 合理安排，或多用几台洗板机。

5 显色 

可能原因：

1） 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；

2） 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。

解决办法：

1） 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的 TMB 显色剂不用；

2） 加样时保持显色剂不外流；

3） A、B 液应避免接触金属器械。

6 终止 

可能原因如加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。所以在加终止液时应避免产生气泡。

7 读板 

如读板时板底不清洁等。应保证酶标板清洁。

在整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸；尽可能实现 ELISA 检测标准自动化，有效提高检测质量。在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时做好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。