三种蛋白测定方法与标准曲线拟合

一、蛋白浓度测定的常见方法

1、考马斯亮蓝g250法测定蛋白浓度（bradford法）

1）实验原理

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝g－250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm吸光度可测定蛋白质的含量。另外，反应体系中呈现的颜色变化主要是g-250分子间疏水相互作用形成的聚集体聚集程度不同引起的。单体形式表现为蓝色，单体和聚集体共存时表现为绿色，全为聚集体形式呈现为棕红色。影响因素主要为溶液体系中磷酸、乙醇、nacl的含量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5μl/ml时就有0.275光吸收值的变化，比lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100μg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10μg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。

2）优缺点

此方法干扰物少，研究表明：nacl，kcl，mgcl2，乙醇，（nh4）2so4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，edta及微量的去污剂如triton x-100，sds，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

3）试剂

①考马斯亮蓝g250溶液：100mg考马斯亮蓝g250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% h3po4，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤即可。

②标准蛋白溶液：纯的牛血清血蛋白(bsa)，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/l nacl配制成1mg/ml蛋白溶液。

3）实验步骤

①绘制标准曲线

摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色。

②未知样品蛋白质浓度测定

取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的a595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。

2、bca法测量蛋白质浓度

1）实验原理

bca检测法是lowry测定法的一种改进方法。蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与cu2+络合生成络合物，同时将cu2+还原成cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。

2）优缺点

与lowery法相比，bca蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与bradford法相比，bca法的显著优点是不受去垢剂的影响。bca法蛋白质浓度检测范围为10-2000 μg/ml。检测0.5~10 μg/ml微量蛋白时应采用浓缩试剂，并需要在60oc反应。

但bca法在样品含有脂类物质时将明显提高光吸收值。蛋白样品中edta或葡萄糖浓度大于10 mm不能使用bca方法。

3）试剂

①bca试剂的配制

试剂a（1l）：分别称取10g bca (1%)，20g na2co3·h2o (2%)，1.6g na2c4h4o6·2h2o(0.16%)，4g naoh (0.4%) ，9.5g nahco3 (0.95) ，加水至1l，用naoh或固体nahco3调节ph值至11.25。

试剂b（50ml）：取2g cuso4·5h2o (4%)，加蒸馏水至50ml。

bca试剂：取50份试剂a与1份试剂b混合均匀。此试剂可稳定一周。

②标准蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。

4）实验步骤

①绘制标准曲线（略）。

②试剂加完后，混匀，于37℃保温30min，冷却至室温后，以0号管为对照，在562nm处比色。

③未知样品蛋白质浓度测定

3、紫外吸收法

1）实验原理

大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大光吸收。当入射光、吸光系数和溶液的光径长度l不变时，这一波长范围内的吸光值与蛋白质浓度成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。

2）优缺点

此操作简便，测定迅速，低浓度盐类不干扰测定。但只适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，容易受到平行物质的干扰，如dna的干扰；此外，此方法敏感度较低，要求蛋白的浓度较高（0.1-0.5mg/ml）。且玻璃器皿会吸收紫外线，需要石英等特殊材料器具。

3）试剂

①标准蛋白质溶液：精确配制2mg/ml的酪蛋白溶液。

②样品溶液

4）实验步骤

①绘制标准曲线（略）

②测定未知样品溶液

5）结果分析

根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。

此外，紫外吸收法也可以不制作标准曲线，直接测280nm的od值，然后通过od值与校正系数直接求得未知蛋白的浓度。

上述三种方法在测定吸光值时，既可以使用紫外分光光度仪、酶标仪，甚至也可以使用nanodrop微量计。它们所需要的样品量逐渐减少，所以制作标曲时不同仪器加入的试剂量也不尽相同，需要具体分析。

二、利用excel软件拟合标准曲线

1、将标准蛋白测得的od值及对应的浓度输入excel表格中，并求出重复测量的平均值。

2、将0ug/ml对照管的od值减去，进行背景校正。

3、将标准浓度和对应的校正值转变为列。（复制，选择性黏贴，转置）

4、选中校正值和浓度的数值，然后找到excel工具栏“插入”，在下拉窗口中选择“散点图”图标，并选择不带曲线的散点图。

5、在弹出的“标准曲线”图中，找到任意一个“散点”，右击该点，在弹出的菜单中选择“添加趋势线”。

6、接着会弹出一个参数选择窗口，在该窗口中选择“线性”趋势线，并勾选”显示公式“、”显示r平方值“。

7、不同的excel版本，略微有些区别，选定参数后，点击“确定“。即可得到完整的标准曲线。一般r平方值≥0.99，即说明该拟合曲线可以使用。

8、将测得的未知蛋白od值代入标准曲线公式”y = 1316.5x – 3.6272“中，即可求得未知蛋白的浓度。