人外周血来源dc的培养心得

我养树突状细胞一年多了，终于有点东西可以回馈丁香园带给我的帮助。

第一：淋巴细胞分离液一定要好，进口的polymorphprep（axis-shield）很不错。这个分离液可出现白雾状的两层 上面的是单核细胞层下面的是多核粒细胞层，上面的就是含有我需要的dc前体细胞。

第二离心力的问题：分离步骤450离心力 洗涤步骤400离心力。这个可以减少血小板。

第三：关于细胞少的问题：经过我多次分离血，发现50毫升的外周血铺板一个6孔板，第六天就集中到两个孔中的细胞数量是2*106个细胞。dc前体细胞少，做实验的时候外周血一定不能太少。

第四：贴壁情况：通常大家使用的是方法较简便的2小时贴壁后取出悬浮细胞，有必要指出，在2小时贴壁后，有很多细胞因为重力作用也在底部，一定要轻轻摇晃培养板，将沉在底部的非铁壁细胞摇起来吸除。一味的球细胞数量，只会降低细胞的纯度。培养到第三天以后 之前贴壁的细胞轻轻摇晃便会浮起来，也属正常。有时候贴壁有时候不贴壁，不要纠结是不是细胞死了，没有死，养就是了，这种半悬浮的状态dc常见。
第五：细胞状态 细胞有增殖 三四天就会发现有细胞克隆团 十几二十个一个团 是养的好的标志 不要纠结要不要吹打开

第六：细胞经lps刺激后的状态与刺激前的状态若要说有差别必须做流式检测表面分子最明显的是b7类的cd80 cd86。

第七：换液丢失细胞的问题：这个问题困扰我很久，因为细胞半贴壁，吸走的情况实属正常，为了减少细胞的丢失，楼主最后迫不得已将换下来的液体放入灭菌15毫升离心管400g 20min离心 重新收集回来 再铺在原孔里 操作要仔细 污染的情况还是不多见的。

第八：细胞不要经常拿出去（显微镜室温度较低）拍照，影响太大了，如果就在细胞房拍照还可以接受。
第九：细胞因子是关键，这个不做赘述。大家都懂。
第十：我上传的图片里，可以看出有的贴壁有的不贴壁 有单个散在的 有巨噬细胞（在红圈里的）大家观赏一下

希望更多地人做dc希望更多的人可以指出文章中的不足，让大家学到更多的东西。