一、发展趋势是否将细菌内毒素检测作为一种新技术载入药典标志着一个国家制药工业、临床医学、生物工程的技术水平。随着历史的发展，必将有更多的国家把它载入药典，将其作为细菌内毒素检查的一个新的法定方法。目前，对内毒素的检查方法约有20多种，已得到FDA批准使用的方法有下述四种：（1）凝胶法（Gel-Clot），这是目前应用最普遍的方法。（2〉基质比色法：这是目前应用发展最快的方法，其主要优点是定量、干扰少，速度快、灵敏度高。终点浊度法（endopoint-turbidimetry）。动力学浊度法（kinetic-tubidimetry）。二、应用范围1、药检上应用需做内毒素检测的品种越来越多，包括饮用水、注射用水、药品、化学试剂、分子生物工程的基因产品、公共环境卫生等。2、药品生产质量控制细菌内毒素检测法在现代制药工业上日益显示出它的应用价值。该法用于药品成品检查，属于药品安全检查项目之一；用于药品生产过程检查属于一种当前质控手段，对提高药品质量、避免造成药品成批报废有重要意义。3、在临床医学上应用20世纪70年代，有研究者用鲎试验发现革兰阴性杆菌感染者血液中存在内毒素或内毒素样物质，其中多数伴有菌血症，临床表现常有发热、休克、黄疽和血管内凝血等，可以归因于内毒素血症。胃肠道是内毒素的来源之一。内毒素是革兰阴性杆菌细胞壁的成分，正常情况下从肠道吸收进入肝门静脉，被肝脏单核-吞噬细胞系统清除，故肝脏在处理内毒素方面起了重要作用。在肝脏功能严重损害和门静脉高压时，肝巨噬细胞减少，解毒功能低下，同时出现肝门静脉和全身循环血管短路，此时内毒素可以出现在无感染证据患者的腹水和血循环中。肠壁黏膜处于缺血状态时内毒素的吸收亦可增加。肠道吸收内毒素的途径有：①黏膜→肝门静脉→肝→体循环。②黏膜→浆膜→腹水→腹腔→体循环。③黏膜→淋巴管→体循环。

在美国、日本、英国、意大利等国，用鲎试验方法检测内毒素首先在药品管理上逐渐取代了热原检测，美国是发明鲎试剂和最先建立鲎试验方法的国家。1956年，美国动物学家Bang发表了论文——“鲎的一种细菌性疾病”，阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象；1964年，Bang和Levin提出了鲎血凝集的初步机制；1968年，Bang和Levin又建立了鲎试验检测内毒素的凝胶法，从而在药物的检测及临床医学上进行了研究和应用；在临床上，20世纪70年代初期即已开始在内科领域中对内毒素进行研究。实验研究认为，肝脏对内毒素的处理起着重要作用，由于肝脏受损，肠内内毒素进入体循环。内毒素与肠的关系密切，尤其是在肝硬化伴有腹水所致的内毒素血症。1973年，美国食品与药物管理局（FDA）认可鲎试剂为一种生物制品；1978年，日本Harada首先创用基质显色法对内毒素进行定量测定成功。基质显色法与凝胶法一样，均利用鲎血变形细胞裂解物中含有被微量内毒素激活的凝固系统设计而成。1980年，FDA发布用鲎试剂来检测人用和兽用注射药成品的内毒素；同年，《美国药典》收载细菌内毒素检测法，但在药典各品种正文中未涉及；1983年，《美国药典》第Ⅰ版第四增补本规定了用细菌内毒素检测取代5种水和40种放射性药品的热原检查。1987年，美国FDA在《鲎试剂检查人用和兽用注射药成品内毒素的准则》中制订了细菌内毒素定量测定法的指导原则，并在1991年对动态法进行了相应的补充规定；1991年《美国药典》第Ⅱ版第五增补本规定了185种药品以细菌内毒素检查取代热原检查；1995年，《美国药典》第Ⅲ版规定了471种药品用细菌内毒素检查法检查，保留热原检查的药品不足40种。目前，《英国药典》1999年版及《日本药典》2000年版均制订了细菌内毒素定量测定法的指导原则。中国是目前世界上鲎试剂产量最大的国家之一。1975~1982年是我国鲎试剂的试制阶段，当时由于缺乏标准研究基础，没有较为统一的实验方法准则，因此在内毒素检测应用上比国外稍晚了一步。1983年，卫生部授权国家药品生物制品检定所组织全国范围的大输液及放射性药品用鲎试剂检测的协作研究；1988年，卫生部颁布了细菌内毒素检测法（凝胶法），允许4种药品使用细菌内毒素检测法初检；1993年，《中国药典》第五版第二增补本收载了细菌内毒素检测法，但未涉及任何品种正文；1995年，《中国药典》第六版二部附录收载了经修订的细菌内毒素检查法，正文规定对注射用水等5种常用药品和9种放射性药品用细菌内毒素检查取代了热原检查（其中浓度为5%及10%的葡萄糖注射液是后来发通知补充的）；1995年，《中国药典细菌内毒素检查法实施会议纪要》提出，争取在3~5年内将我国上百种药品由热原检查改为细菌内毒素检查（凝胶法）。2000年版的《中国药典》收载的药品品种较1995年版有了明显增加，已由原来局限的5种大输液和9种放射药品共14个品种扩大到67个品种，其中抗生素29种、化学药品10种、生化药品9种、放射药品19种，并制订了细菌内毒素检查法应用指导原则，其中规定应用凝胶法的同时可做定量法（终点浊度法、终止显色基质法及动态显色基质法）予以参比。国内在1980年开始应用鲎试剂做临床有关疾病的检测；于1985年开始应用定量法（基质显色法）检查血液、尿液、脑脊液、腹水及生物制品中的微量内毒素。如今，《中国药典》中的细菌内毒素检查法不断完善，《中国药典》2025年版将在2023年11月7-9号对编制进展和拟增修订共性标准内容进行介绍和解读，让我们拭目以待。

鲎血变形细胞的低渗提取液，即鲎变形细胞裂解物，含有一种高相对分子质量的凝固酶原和一种可凝固的蛋白——凝固蛋白原，前者经内毒素激活后转化成具有活性的凝固酶，通过酶介作用使凝固蛋白原转变成凝固蛋白。1972年，Young等首先报道在去热原的条件下用Sephadex G-75分离美洲鲎变形细胞裂解物中的凝固蛋白原，可得到三部分物质，第一部分F1占总裂解物蛋白的30%，含有能被内毒素所激活的酶。第二部分F2占总裂解物蛋白的50%，为可凝固的蛋白，即凝固蛋白原。第三部分占15%，性质不清。1973年，Solum成功地自美洲鲎变形细胞裂解物中分离提纯出凝固蛋白原，并经SDS凝胶电泳检测其相对分子质量为23000±900。1976年，Nakamura等报道自日本鲎变形细胞中分离提纯出凝固蛋白原并对其生化性质进行了研究。日本鲎凝固蛋白原的相对分子质量按SDS凝胶电泳法检测为19500±1000；按氨基酸组成计算为15770；按超离心沉降平衡计算为15300。凝固蛋白原为单肽链结构，由132~135个氨基酸残基组成，其氨基末端为丙氨酸，羧基末端为苯丙氨酸，是一种碱性蛋白。1977年，Tai等测得美洲煊凝固蛋白原的相对分十质量为24 500(SD 慨欣巴孙依)，由220个氨基酸残基组成，其氨基末端为甘氨酸，羧基末端为丝氨酸。1978年，Shishikura等报道了对三种亚洲鲎及美洲鲎凝固蛋白原的生化及免疫特性的比较研究。他们发现：这四种鲎的凝固蛋白原的相对分子质量按SDS凝胶电泳测定均为20000左右；三种亚洲鲎的凝固蛋白原有共同的抗原性，但和美洲鲎的凝固蛋白原无共同的抗原性。1979年，丹羽允等曾对上述四种堂的凝固蛋白原进行研究，发现三种亚洲鲎凝固蛋白原的氨基酸排列顺序相同﹐但和美洲鲎相比，则有很大差别。

1、制备采血的鲎要新鲜或用经人工养殖几天后的健康鲎，采血时血流必须通畅。采血量大，试剂质量也高，但不同季节鲎血的质量也有差异。2、在制备TL的全过程中均须无菌操作，动作应轻，以防止细胞破裂。使用器具均须清洗干净并去热原。作者曾对器具做硅化与不硅化处理的比较，其结果发现器具硅化与否不影响灵敏度。因此，只要器具干净并已去热原即可以不硅化。3、在抗凝剂方面，作者使用的茶碱量较大，观察发现其细胞形态均正常，在采血瓶中分散均匀，且发生聚集的时间后移。之后再用抗凝剂2洗1次，有利于将血蓝蛋白除去。除茶碱外，其他抗凝剂是否也可加大用量尚需探索。4、氯化钠一般用来配制抗凝剂与洗脱液，常用2.95%~3%的氯化钠溶液，其浓度与海水浓度相当。作者曾观察4%浓度的氯化钠溶液对变形细胞的影响，随着观察时间的延长，3%浓度的氯化钠溶液中的变形细胞逐渐破裂溶解，并在洗涤中形成小块，而4%的氯化钠溶液中的细胞仍然均匀分散。作者对两种不同浓度氯化钠制品的质量尚未进行深入的比较。5、关于重组鲎试剂：PyroSmart NextGenTM(PSNG)重组鲎试剂是一种基因工程合成的细菌内毒素定量检测试剂，PSNG鲎试剂完全模拟了天然鲎试剂LAL的酶联反应，包含重组C因子、重组B因子、重组凝固酶原，且剔除了容易引起假阳性的G因子，不依赖鲎血，满足可持续发展的目标，可以应用动态显色法进行测试和分析。PSNG是一种灵敏而灵活的试剂，可用于USP、JP的细菌内毒素测试章节进行动态显色法细菌内毒检测，不需要更换方法和设备，操作简便易行。在PyrosKinetix®Flex细菌内毒素定量检测系统及酶标仪上，PSNG和样品可以按照50微升：200微升的比例使用，极大的节约试剂消耗。【重组鲎试剂优势】检测便利：不需要更换方法和设备快速高效：完成实验仅需(10-30)分钟节约试剂：鲎试剂使用量仅需50微升灵敏度高：灵敏度可达0.001EU/mL，实际可达0.0005EU/mL特异性：PSNG不与(1,3)-β-D-葡聚糖发生反应，杜绝了假阳性结果。药典法规护航：USP、EP、JP、ChP药典法规收录

我们了解到，鲎血液中含有一种细胞即变形细胞，这种细胞内的溶解物（裂解物tachypleus lysate，TL）可与微量细菌内毒素起凝集反应，这是由TL中的一种酶被细菌（革兰阴性菌）细胞壁成分——脂多糖激活，使其蛋白质形成凝胶所致。为此人们已阐明了这方面的理论机制，并已着手利用各种技术从自然界存在的某些物质中把它提取出来，实践并应用于社会，鲎变形细胞内的溶解物主要有两种，凝固蛋白原及凝固蛋白酶原。这两种物质提取后，即为检测内毒素的益试剂，它的检测灵敏度高低取决于制备擞血细胞溶解物的质量。因此，在制备提取过程中不能有微量的内毒素进入，所以，鲎试剂的制备提取过程是有相当难度的。一、材料与制备1、鲎 采用我国东南沿海地区的鲎即东方鲎（中国鲎），采血量最多为400ml，平均200ml（需根据体重大小而定），其变形细胞数最高为5×1011/L以上，平均为4×1010/L。2、器材及处理 准备采血瓶（250ml玻璃瓶）注射器等用具，经洗涤后放在重铬酸钾与硫酸的清洁液中浸泡过夜，然后用无内毒素的流水冲洗3次，晾干后于260℃烤箱内烘干3h备用。采血针、管均需用一次性无菌采血器（均无内毒素）。3、试剂配制 以下试剂中凡是固体试剂均需预先去除内毒素，去内毒素的方法要视各种试剂的耐热度而定，一般用80~120℃不间断烘烤约10h左右。配制试剂用的重蒸馏水应不含内毒素（小于0.03EU/ml内毒素含量）。抗凝剂1：茶碱（theophylline）2g；磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2g；氯化钠40g；无内毒素蒸馏水1000ml。抗凝剂2：茶碱0.36g；磷酸氢二钠2g；氯化钠4g；无内毒素蒸馏水1000ml。（3）洗涤液：磷酸氢二钠2g；氯化钠40g；无内毒素蒸馏水1000ml。（4）裂解液：将0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷（Tris）用盐酸调节至pH值为7左右，也可加入二价阳离子如Ca2+、Mg2+、Mn2+等提高灵敏度。二、制备步骤1、采血 取活鲎用水冲洗，将鲎屈曲，露出头、胸、腹三节交界处，用碘酒擦拭后用酒精消毒。取15G针头一次性输血器，针尖插入盛有100ml抗凝剂1的瓶中，另一端的针头刺入鲎的头腹部关节处深入约1～2cm，蓝色血液就流入瓶内，每瓶采血100ml，注意稳定针头，使其不要移动。在采血过程中，鲎血应是顺畅地流入瓶中，若发生间歇滴入就容易凝固，应即弃去不用。采血后立即用1000r/min离心约2min。离心后，变形细胞沉积于瓶底，呈白色，此时弃去上层蓝色血液即可。2、洗涤用抗凝剂2-20ml加入瓶中轻轻摇晃，使沉淀的变形细胞均匀地分散混悬于抗凝剂中，然后以1000r/min离心1min。弃去上清液后用4%氯化钠磷酸盐溶液洗涤3次，之后再次离心约1500r/min 1min，将细胞压实，弃去上清液。3、裂解将压实的变形细胞加入约3倍裂解液后使细胞计数在5×1011/L，变形细胞100ml沉淀物加裂解液10ml。然后放置于4℃的冰箱内，每天震荡2次，以使细胞裂解完全。析出的液体应透明无色。4、分装冻干将裂解物以3000r/min离心15min，收集上清液分装于安瓻中，放置于医用冷冻干燥机中，-30℃快速冷冻，然后于真空状态下升温干燥，升温不超过20℃。冷冻干燥后即可得到标准灵敏度的鲎试剂成品。三、制品检测1、使用凝胶法进行鲎试剂成品内毒素测定，标准内毒素含量为10EU/支，准确加λ无内毒素用水（以下简称水）1.0ml，溶解，用封口膜封住安瓿口。2、将封口安瓿放λ旋涡混合器上旋涡混合，一般情况下国家标准品是20~30min，工作标准品是10~15min（其要求的理由下述会阐明）混合时注意不要使安瓿内溶液沾上封口材料。3、将混合好的内毒素溶液（此时浓度为10EU/ml）用水稀释为2λ、λ、0.5λ及0.25λ浓度的系列浓度（λ为灵敏度），即1.0、0.5、0.25、0.125EU/ml浓度的系列溶液。4、操作方法：①取20支无内毒素试管分为4组，每组分别标记上E1、E0.5、E0.25、 E0.125、E0（空白管阴性对照）。②分别吸取鲎试剂0.1ml 加入E0至E1的对应试管。③E0管加入0.1ml水，其余各管加入0. 1ml与管上标注数字相同浓度的标准内毒素。④用封口膜封闭试管，将试管内容物轻轻摇匀。⑤把试管架放入37±2℃的恒温水浴中保温60±2min。在保温过程中不能有任何震动，以免影响反应的正常进行。保温时间结束后将试管取出观察结果，注意，E0管需保温至4h才取出观察结果。⑥实验结果判断：将试管缓慢翻转180°，若管内凝胶显示坚实不变形为阳性，记录为“+”；若无凝胶出现﹐或疑有凝胶但不能保持完整，从管壁滑脱，均判为“阴性”，记录为“－”。

我们了解到，鲎血液中含有一种细胞即变形细胞，这种细胞内的溶解物（裂解物tachypleus lysate，TL）可与微量细菌内毒素起凝集反应，这是由TL中的一种酶被细菌（革兰阴性菌）细胞壁成分——脂多糖激活，使其蛋白质形成凝胶所致。为此人们已阐明了这方面的理论机制，并已着手利用各种技术从自然界存在的某些物质中把它提取出来，实践并应用于社会，鲎变形细胞内的溶解物主要有两种，凝固蛋白原及凝固蛋白酶原。这两种物质提取后，即为检测内毒素的益试剂，它的检测灵敏度高低取决于制备擞血细胞溶解物的质量。因此，在制备提取过程中不能有微量的内毒素进入，所以，鲎试剂的制备提取过程是有相当难度的。一、材料与制备1、鲎 采用我国东南沿海地区的鲎即东方鲎（中国鲎），采血量最多为400ml，平均200ml（需根据体重大小而定），其变形细胞数最高为5×1011/L以上，平均为4×1010/L。2、器材及处理 准备采血瓶（250ml玻璃瓶）注射器等用具，经洗涤后放在重铬酸钾与硫酸的清洁液中浸泡过夜，然后用无内毒素的流水冲洗3次，晾干后于260℃烤箱内烘干3h备用。采血针、管均需用一次性无菌采血器（均无内毒素）。3、试剂配制 以下试剂中凡是固体试剂均需预先去除内毒素，去内毒素的方法要视各种试剂的耐热度而定，一般用80~120℃不间断烘烤约10h左右。配制试剂用的重蒸馏水应不含内毒素（小于0.03EU/ml内毒素含量）。抗凝剂1：茶碱（theophylline）2g；磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2g；氯化钠40g；无内毒素蒸馏水1000ml。抗凝剂2：茶碱0.36g；磷酸氢二钠2g；氯化钠4g；无内毒素蒸馏水1000ml。（3）洗涤液：磷酸氢二钠2g；氯化钠40g；无内毒素蒸馏水1000ml。（4）裂解液：将0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷（Tris）用盐酸调节至pH值为7左右，也可加入二价阳离子如Ca2+、Mg2+、Mn2+等提高灵敏度。二、制备步骤1、采血 取活鲎用水冲洗，将鲎屈曲，露出头、胸、腹三节交界处，用碘酒擦拭后用酒精消毒。取15G针头一次性输血器，针尖插入盛有100ml抗凝剂1的瓶中，另一端的针头刺入鲎的头腹部关节处深入约1～2cm，蓝色血液就流入瓶内，每瓶采血100ml，注意稳定针头，使其不要移动。在采血过程中，鲎血应是顺畅地流入瓶中，若发生间歇滴入就容易凝固，应即弃去不用。采血后立即用1000r/min离心约2min。离心后，变形细胞沉积于瓶底，呈白色，此时弃去上层蓝色血液即可。2、洗涤用抗凝剂2-20ml加入瓶中轻轻摇晃，使沉淀的变形细胞均匀地分散混悬于抗凝剂中，然后以1000r/min离心1min。弃去上清液后用4%氯化钠磷酸盐溶液洗涤3次，之后再次离心约1500r/min 1min，将细胞压实，弃去上清液。3、裂解将压实的变形细胞加入约3倍裂解液后使细胞计数在5×1011/L，变形细胞100ml沉淀物加裂解液10ml。然后放置于4℃的冰箱内，每天震荡2次，以使细胞裂解完全。析出的液体应透明无色。4、分装冻干将裂解物以3000r/min离心15min，收集上清液分装于安瓻中，放置于医用冷冻干燥机中，-30℃快速冷冻，然后于真空状态下升温干燥，升温不超过20℃。冷冻干燥后即可得到标准灵敏度的鲎试剂成品。三、制品检测1、使用凝胶法进行鲎试剂成品内毒素测定，标准内毒素含量为10EU/支，准确加λ无内毒素用水（以下简称水）1.0ml，溶解，用封口膜封住安瓿口。2、将封口安瓿放λ旋涡混合器上旋涡混合，一般情况下国家标准品是20~30min，工作标准品是10~15min（其要求的理由下述会阐明）混合时注意不要使安瓿内溶液沾上封口材料。3、将混合好的内毒素溶液（此时浓度为10EU/ml）用水稀释为2λ、λ、0.5λ及0.25λ浓度的系列浓度（λ为灵敏度），即1.0、0.5、0.25、0.125EU/ml浓度的系列溶液。4、操作方法：①取20支无内毒素试管分为4组，每组分别标记上E1、E0.5、E0.25、 E0.125、E0（空白管阴性对照）。②分别吸取鲎试剂0.1ml 加入E0至E1的对应试管。③E0管加入0.1ml水，其余各管加入0. 1ml与管上标注数字相同浓度的标准内毒素。④用封口膜封闭试管，将试管内容物轻轻摇匀。⑤把试管架放入37±2℃的恒温水浴中保温60±2min。在保温过程中不能有任何震动，以免影响反应的正常进行。保温时间结束后将试管取出观察结果，注意，E0管需保温至4h才取出观察结果。⑥实验结果判断：将试管缓慢翻转180°，若管内凝胶显示坚实不变形为阳性，记录为“+”；若无凝胶出现﹐或疑有凝胶但不能保持完整，从管壁滑脱，均判为“阴性”，记录为“－”。

热原（pyrogen）指在临床上能使哺乳动物产生热原反应的物质。关于热原的定义在学术上尚有争论。热原是否就是内毒素在学术上也有争议。但在药检的范畴，可以说无内毒素就是无热原，检测内毒素就是检测热原。随着科学的进步，通过对鲎血液细胞溶解物及内毒素的深入研究发现，鲎血液细胞的溶解物包含了与内毒素反应所需的全部凝集因子，它们与内毒素的反应是一种复杂的酶促反应。1964年，Bang和Levin首先提出鲎血凝集的初步机制，并用鲎试验检测内毒素。1968年，Marchalon精制成功鲎试剂，此后鲎试剂作为一种检测内毒素血症的简便而灵敏的方法逐步推广于临床。从上文鲎试剂（包含有凝固酶原及凝固蛋白原）与内毒素的反应机制可以看出，这种凝集反应是一系列复杂的酶促反应，任何因素影响到反应的任一过程的正常进行，都会影响到检查结果的准确性，即出现所谓“假阴性”或“假阳性”的结果。通常的影响因素有pH值、离子浓度以及某些干扰成分。只有证实检品对凝集反应无干扰之后，检查的结果才是可信的。最初人们以为鲎试剂是专一对内毒素反应的试剂。随着研究的深入，人们发现鲎试剂除了含有能被内毒素激活的凝集因子外，还存在着能被其他物质激活的G因子。活化的G因子同样可以激活凝固酶原，从中可以看出，鲎试剂存在“旁路”激活路线。通常称由“旁路”反应而致的阳性结果为细菌内毒素的“假阳性”。近期的研究证实，(1,3)-β-葡聚糖类物质（如真菌多糖）能激活益试剂的旁路。此外，1981年在美国的内毒素标准品及鲎试剂应用国际会议上，Carson等提出了一个“鲎试剂反应物”（LAL-reactivematerial，LAL-RM）的术语，认为除了(1,3)-β-葡聚糖外，还存在着LAL-RM这类物质可以激活鲎试剂旁路。LAL-RM的存在是由于在用鲎试剂检查人工肾血液透析冲洗液中的内毒素时出现呈弱阳性而发现的。

鲎（Tachypleus，limulus）为大型节肢动物，属蜘蛛风，现共有2属5种：Limulus属的Polyghemus种，分布于北美洲东部沿海；Tachypleus属的Tridentafus种、Gigas种和Boeveni种分布于中国、日本东南部及马来西亚、泰国、菲律宾一带；Carcinoscorpius属的Rotundieauda种则分布于印度洋沿岸。中国及日本鲎经鉴定为Tachypleus tridentatus（东方鲎或中国鲎）。美国鲎是一种古老的、有4亿年历史的海洋节肢动物，其身上覆盖以坚硬的厚甲，体形似瓢，体色棕褐，体分胸，腹及尾剑三部分。鲎的血液在体内无色，流出体外与空气接触后立即变成蓝色，这是由于其血液中含有血蓝蛋白（hemocyamin）所致。鲎的血液中除极少数为含有血蓝蛋白的原蓝细胞外，约99%为变形细胞。形态观察可见，变形细胞大体为圆形或椭圆形，核呈异圆形或卵圆形。变形细胞内含有两种颊型的颗粒，分为第一型颗粒和第二型颗粒，第二型颗粒数量很少。现从形态学观察已肯定，第一型颗粒和凝血过程密切相关。通过低渗提取的鲎变形细胞裂解物（amoebocyte lysate）含有一种高相对分子质量的凝固酶原（proclotting enzyme）和一种可凝固的蛋白——凝固蛋白原（coagulagen），前者经内毒素激活后转化成具有活性的凝固酶（clotting enzyme），通过酶介作用使凝固蛋白原变成凝固蛋白（coagulin）。最近，高本尚等分析出了东方鲎凝固蛋白原全部结构的175个氨基酸序列及16个半胱氨酸残基。1956年，美国生物学家Bang报道，革兰阴性细菌或其抽取物可导致鲎血凝固，而革兰阳性细菌却没有这样的作用。随即在1964年，Levin和Bang证实了上述实验中可使鲎血凝固的物质为内毒素。1968年，他们又证实了鲎血凝固的所有因子均来自鲎血中具有多功能的单一细胞——变形细胞。鲎变形细胞（amoebocyte）的直径约10～20Mμm，这种有核细胞内含有高密度的颗粒，在干涉相差显微镜下可观察其细胞的动态，当内毒素加入细胞中后很快就引起细胞颗粒的脱失和细胞崩溃坏死，继而形成凝胶。另外，在电镜观察中有两种不同情况，即当变形细胞和内毒素接触时脱颗粒细胞膜剥离，另外细胞溶解形成纤维状凝胶物质。以上关于鲎与内毒素之间相互作用关系的阐述，仅仅是在原始动物和细菌中的内毒素之间。非常微量的内毒素侵入到鲎的血液内，就会发生血液的凝固。虽然内毒素致鲎血凝固的机制已了解清楚，内毒素与人血之间的关系尚不清楚。

尽管经过数十年的不懈努力已发展了许多抗内毒素的战略及具体药物，但至今为止的一切治疗措施都不能令人满意。虽然这些治疗措施在动物及少数患者中的应用显示有益，但大量临床应用则显示无明确的治疗效果，甚至无效。因此，目前的研究距将来临床广泛使用有效的抗内毒素治疗还有很大距离。一般认为，研究失败的主要原因是由于目前对LPS受体信号转导途径的了解还不十分清楚。虽然已发现了某些细胞受体如CD14的信号转导途径，但由于研究者往往过高地估计了这些受体的作用，因而忽视了受体之间的互相联系。（1）开始，CD14被认为是LPS特异的受体，现在认为它是一种构型识别受体（pattern-recoganition receptor），可与许多G-杆菌及G-杆菌成分起作用，也可与酵母菌成分如肽糖苷亚油酸（peptidoglycanlipoteichoicacid）、脂阿拉伯糖（lipoarabinomannan）和不同的多糖成分起反应。（2）CD14不是LPS反应必需的受体，因为抗CD14抗体不能阻断单核细胞对高浓度LPS的反应；同样，在CD14基因敲除小鼠中，LPS诱导产生的急性时相蛋白不受影响。在某些LPS反应细胞中，不一定有CD14的表达，如肝巨噬细胞及骨髓粒细胞。（3）LPS受体与别的受体如嘌呤受体及PAF受体互相联系。（4）除CD14外，其他受体分子也参与LPS的信号转导，包括低亲和受体和近来发现的Toll样受体家族。因此，继续研究LPS信号转导途径是发展内毒素治疗方法的基础，只有了解其信号传导过程，才能有效地选择某些环节，终止信号转导，最后阻止内毒素的有害反应。

中性粒细胞被激活后，移至靶组织，释放出许多毒性分子，损伤组织细胞，导致器官衰竭。TNF-α和IL-1可促进内皮细胞ICAM-1、ELAM-1和VCAM-1的表达。中性粒细胞及内皮细胞上的受体参与白细胞边缘流动及黏附于血管内皮细胞，中性粒细胞移动至炎症部位（肝或肺泡腔）后，黏附于靶组织上并脱颗粒，释放出破坏性分子，如超氧化合物、氧自由基及各种酶蛋白。如果黏附分子介导的细胞与细胞之间的反应包括与靶细胞或内皮细胞间的反应被抑制，组织损伤可能得以减轻或完全阻止。这方面的研究表明，抗ICAM-1抗体能防止LPS诱导的致死性，抗CD31抗体能减少LPS诱导的粒细胞介导的肝毒性作用。硫化糖脂是L-选择素或P-选择素的自然拮抗剂，也能防止LPS诱导的对小鼠的致死作用。因此，拮抗黏附分子的治疗可能有防止器官衰竭如肝功能衰竭或ARDS的作用。在抗组织损伤的治疗中，灭活中性粒细胞脱颗粒所释放的有害分子的抑制剂（蛋白溶解酶、超氧化合物和氧自由基）也可使用，某些蛋白酶抑制剂的作用已相当明确；许多抗氧化剂的疗效也已经过初步研究，其中某些制剂可能有用。近来的研究表明，用抗氧化剂U83836治疗小鼠动物模型能减轻LPS诱导的低血压作用，降低TNF-α水平，使其免受LPS的致死作用。

本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。本试验操作过程应防止内毒素的污染。细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制，并以细菌内毒素国际标准品标定其效价。用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或小于0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。鲎试剂是从鲎的血液中提取出的冻干试剂，可以与细菌内毒素发生凝集反应。除了内毒素，鲎试剂还与某些β-葡聚糖反应，产生假阳性结果。如遇含有β-葡聚糖的样品，可使用去G因子鲎试剂或G因子反应抑制剂来排除鲎试剂与β-葡聚糖的反应。试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、至少30分钟）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0~8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。所用溶剂、酸碱溶液及缓冲液应不含内毒素和干扰因子。

各有关单位:    为了进一步帮助药品检验检测机构和相关制药生产企业提升细菌内毒素检测能力，海南省药师协会联合科德角国际生物医学科技（北京）有限公司定于2023年11月14日-15日在海口举办“细菌内毒素检测技术应用及光度法细菌内毒素定量检测实操培训班”。现将有关事项通知如下:一、培训组织主办单位：海南省药师协会协办单位：科德角国际生物医学科技（北京）有限公司二、培训对象药品生产企业、医疗器械生产企业、药检所以及医疗机构从事细菌内毒素检查工作的质检人员。三、培训时间、地点及费用（一）培训时间：11月14日-15日，培训为期1.5天；（二）培训地点:海南省海口市龙华区金盘南侧建设一横路1号吉兴雅苑1栋一楼109会议室。（三）培训费500元/人（含资料费、中餐费、证书费等）。四、培训讲师尹雪雁 科德角国际资深技术主管秦焕甲 科德角国际高级应用工程师五、培训内容（一）细菌内毒素基础知识及2025版中国药典细菌内毒素检查法趋势介绍1、内毒素、鲎试剂和内毒素检测概述2、鲎反应干扰因素及方法选择3、细菌内毒素检查法法规介绍（二）细菌内毒素光度法检测开发实例分享1、细菌内毒素光度检测开发实例2、基因重组鲎试剂方法介绍（三）细菌内毒素定量检测系统的应用指导1、计算机要求2、数据库3、Pyros® eXpress 软件安装和注册4、通用设置的介绍5、库的介绍6、检测模板介绍7、软件扩展（四）细菌内毒素定量检测系统的现场实操培训六、报名（一）参训人员用微信扫以下二维码报名，报名截止时间为：2023年11月10日18:00，有特殊情况请与李老师联系联系方式：400-860-5168转5075 七、其他事项联系电话：400-860-5168转5075办公地址：海口市龙华区金盘建设一横路1号吉兴雅苑西门1栋一楼102室。

败血症时许多细胞因子（IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α）水平增加，已发现感染性休克的死亡与血清内细胞因子的水平密切相关，特别是与IL-6水平关系更加密切。其实IL-6水平的增加主要受IL-1和TNF-α水平的影响。由于血浆中含有IL-1及TNF-α抑制物（IL-1Ra以及可溶性TNF受体P55和P75），因此直接测定血浆内IL-1及TNF-α浓度并不可靠，这可能也是临床上发现IL-1及TNF-α水平与败血症病死率关系不如IL-6密切的原因之一。败血症的许多生物效应可通过用IL-1和TNF-α静脉注射而仿制出来，而IL-6静脉注射，即使是大剂量时对人体也无大的作用（除头痛及发热外），因此认为IL-6不是感染性休克产生的原因，但也不能排除它与其他因素一起参与感染性休克的发生。IL-8的产生受TNF-α的影响，具有激活中性粒细胞的作用及化学趋向特征，可参与内毒素血症及败血症时的中性粒细胞介导过程，但其确切作用仍不完全清楚。在细胞因子产生抑制物中，研究最多的仍是糖皮质激素，但目前临床研究认为糖皮质激素不能改善败血症患者的生存率。近来还发现了一些其他细胞因子抑制剂，如抗炎细胞因子（IL-4、IL-10）或抑制促炎细胞因子成熟过程所需的酶（如calpain、IL-1β转换酶、锌金属蛋白酶），还有一些中和细胞因子的制剂，如IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra）、可溶性TNF-α受体（P55及P75）及IL-1与TNF-α的中和抗体。另外，神经内分泌系统对免疫和炎症反应起强有力的调节作用，下丘脑-垂体-肾上腺轴皮质激素是细胞因子作用的自然调节剂，促肾上腺皮质激素可通过皮质醇的产生而抑制细胞因子的分泌；α-黑素细胞激素（α-MSH）能拮抗细胞因子的发热及促炎作用，并被发现也有抗内毒素休克作用。HP-228是人工合成的7肽α-MSH类似物，具有更强的抗内毒素休克作用。但使用细胞因子抑制物必须慎重，因为细胞因子的作用机制非常复杂，它们通过一个互相依赖、互相促进、互相抑制的网络系统发挥作用。拮抗其中的某种细胞因子，可能使网络调节紊乱，利少弊多，因为细胞因子的产生常是宿主代偿反应的标志。如亚致死量的TNF-α能诱导内毒素耐受，保护动物免受LPS的致死作用，而清除TNF-α和IL-1后，机体处于免疫抑制状态，所以这些可能是使细胞因子治疗的临床效果不能令人满意的原因之一。

有研究报道，嘌呤介导信号与LPS信号转导之间存在着直接或间接的联系。含腺嘌呤碱基的化合物可调节LPS的作用。嘌呤类似物2-甲硫-ATP可保护小鼠免受内毒素的致死作用。另有报道称2-氯-ATP和其他腺嘌呤衍生物如腺苷激酶抑制剂GPss对内毒素血症动物也有保护作用。人工合成的腺苷和真菌代谢产物马兜铃霉素（aristeromycin）类似物（the adenyl carboxyclic necleotide MDL201112）也可保护小鼠免受内毒素的致死作用，可能是通过抑制5-腺苷-同源脱氨酸水解酶，并进一步抑制了TNF-α基因的转录。LPS通过激活磷脂酶及磷酸水解酶可使机体产生许多脂质介质，如花生四烯酸、溶细胞磷脂﹑磷酸及PGA。三环十烷黄原酸盐可抑制磷脂酰胆碱分解，噬菌灵可抑制磷酸产生，两者均对内毒素休克有保护作用。磷脂酶作用所产生的花生四烯酸在5-脂氧化酶途径中产生白细胞三烯（LTC4，LTD4和LTE4），调节血管通透性。化合物MK886是白细胞三烯生物合成的强有力的抑制剂，对内毒素休克的治疗有效。

有许多蛋白激酶参与LPS的细胞内信号转导，其中几种蛋白激酶抑制剂已证明对内毒素血症及败血症治疗有效，特别有效的是PKC抑制剂H-7，酪氨酸激酶抑制剂tyrphostins：AG126及AG556及P338激酶抑制剂SB203580。NF-κB参与与炎症有关细胞的基因调节，pyrrolidinedithio-carhamate是一种NF-κB的抑制剂，α-Benzolamino-1，4-naphthoquinoure（PPM18）是NF-κB抑制剂的稳定剂，两者联合使用对内毒素血症及败血症动物模型的治疗非常有效，能防止动物各器官的损伤，保护动物免受因内毒素及感染所致的死亡。但目前仍未能得出最后结果，还需进一步的动物实验及临床试验才能明确。用数种黄嘌呤衍生物抑制磷酸二酯酶可使细胞内的cAMP水平升高、TNF-αmRNA表达减少。已有报道称己酮可可碱（pentoxifylline）可抑制人志愿者LPS诱导的TNF-α的释放，并可增加内毒素休克动物模型的生存率；但己酮可可碱减少TNF-α释放所需的剂量较大，可产生一定的不良反应，欧洲已有静脉用的己酮可可碱应用于临床治疗，但在美国未予准许。

有关LPS作用的具体细节虽不完全了解，但此环节已经清楚，内毒素进入体内后可激活体液及细胞反应，产生一系列严重后果。在体液方面，LPS可激活补体途径，影响凝血系统、增加纤维蛋白形成，减少纤维蛋白清除，最后导致凝血功能的紊乱，发展为DIC。除体液作用外，LPS还可刺激数种细胞分泌许多活性分子。经LPS刺激后，B细胞多克隆激活，分泌免疫球蛋白；浆细胞和嗜碱粒细胞产生化学趋化因子、组胺和5-羟色胺；血小板分泌生长因子及凝血因子；中性粒细胞释放活性氧；巨噬细胞及内皮细胞产生和释放细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）。单核-巨噬细胞如何识别LPS，LPS的信号在细胞内如何转导？目前已清楚，单核-巨噬细胞与LPS反应至少需要两种成分参与，一种成分为LPS结合蛋白（LBP），另一成分即为细胞受体CD14。由于LPS具有双向性，在体液中常有乳化倾向，使许多LPS单体乳化成LPS聚集体。LBP对LPS具有高度的亲和性，并能解离聚集的LPS，组成LPS-LBP复合物，并转运至细胞膜上的CD14分子。CD14是一种糖蛋白，经由GPI锚定在髓样细胞膜上。由于GPI尾部不跨越整个细胞膜上与信号传导器相连，因此肯定有其他受体参与信号的传导。最近Janeway等发现，Toll样受体家族至少由10个Toll样受体组成，其中Toll样受体4（TLR4）可激活NF-iB和诱导其他细胞因子的表达。而后，Yang等发现了该家族的另一种蛋白，它在所有淋巴样细胞中表达，并能在膜外与LPS结合，在细胞内区域传导LPS反应，可能为另一个Toll样受体。但TLR4似乎是CD14的共同受体，它直接受LPS介导，使细胞因子释放。尽管LPS受体拮抗剂对内毒素的治疗有一定疗效，但问题是其必须在内毒素与受体结合前应用，否则疗效将会受到影响。另一措施是阻断LPS信号转导，数条信号转导途径涉及多种蛋白激酶，如PKC、PTK、MAP激酶及脯氨酸介导蛋白激酶等，这些转导信号呈瀑布样过程促使大量的促炎细胞因子（IL-13、IL-6、TNF-α）和其他介质（NO）释放，这些细胞因子及介质又可进一步作用于靶细胞，激活靶细胞内的许多酶并造成继发性的瀑布过程，如激活磷脂酶（PLA2）、磷脂酰胆碱、CPC、PLC、PLD、磷脂水解酶，促进脂质介质的释放。后者进一步激活许多蛋白酶并经二己酰甘油鞘磷脂酶﹑酰基鞘氨醇及NF-κB等途径产生细胞毒作用。抑制这些转导过程，可能对治疗内毒素的细胞毒性作用有效。

理论上如能阻止LPS与组织细胞上的受体结合就能阻断内毒素的毒性作用。E5531是一种内毒素拮抗剂，是根据荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）脂质A（RcLA）的结构合成。RcLA能抑制其他细菌LPS诱导的细胞因子产生。E5531与RcLA一样对内毒素具有拮抗作用，但与RcLA不同，它对内毒素无强力的拮抗作用，即使提高E5531的浓度也是如此。如果在E5531的C3及C3'位点连接处以己酰连接取代后，其拮抗内毒素的作用明显增强，这是由于己酰连接能防止水解作用。用甲基阻断C6处羧基后﹐E2231的稳定性也大大提高。有关E2231的作用机制是它可能在细胞受体水平抑制了LPS的作用，特别是对脂质A的作用。E2231对细胞受体的亲和力大于脂质A。各种内毒素的作用是通过脂质A起作用的，因此E2231能拮抗各种内毒素对单核细胞诱导的TNF-α释放作用。实验也证明，它能阻止内毒素诱导的全身单核细胞释放IL-1、IL-6、IL-8及IL-10，也能阻止巨噬细胞释放NO。LPS浓度越高，所需起抑制作用的E5531的量也越大。在静注LPS 的小鼠中，E5531能抑制TNF-α的释放并减少死亡率，疗效呈剂量依赖性。另一研究比较了E5531与β-lactim 抗生素对E.coli腹膜炎小鼠的治疗作用，发现E5531或抗生素单独使用只能对小鼠提供暂时的保护作用，如联合应用则可明显延长对动物的保护作用，提高长期生存率。按此设计，联合用药组7d后仅有4/30的小鼠死亡，而单用E5531，有6/30的小鼠死亡，单用抗生素有21/30的小鼠死亡。联合应用能提高保护效果的机制可能是在应用抗生素时，大量细菌被杀死，释放出大量内毒素，如果同时应用E5531，能有效地拮抗内毒素的作用。E5531与抗生素联合应用可减少内毒素对机体的毒性作用，提高抗生素治疗败血症的疗效。目前，E5531对败血症的临床疗效试验正在进一步实验中。

研究者早已证明，通过血流灌注或血浆交换技术能有效地清除血液中的内毒素。Iwai等应用血浆交换技术治疗了16例急性重症肝炎患者，结果显示：血浆交换治疗患者血中的内毒素浓度、TNF-α和IL-6浓度明显降低。Janhon等也获得了同样的结果，他用血浆交换技术治疗感染性休克患者，其中62%患者的TNF-α被清除，减少了TNF-α对各个器官的毒性作用。因此，通过血浆交换可有效地清除体内的内毒素及各种促炎细胞因子，可作为治疗急性重症肝病或败血症患者的有效措施之一。这种治疗需要大量的新鲜血浆，且技术费用较高，此外还存在着过敏、感染HCV及HIV等缺点，因此限制了它在临床的广泛使用。至今，对血流或血浆灌注技术的研究已有多年，所用的吸附剂有多种，如多黏菌素B、甘氨酸、组胺等，临床及动物实验表明不同吸附剂的疗效不一。多黏菌素B早已被证明具有抗内毒素作用，但由于它具有对中枢神经系统及对肾脏的明显的毒副作用，因此限制了临床静脉使用，但多黏菌素B仍具有与内毒素脂质A结合的特性。有人把多黏菌素作为配体，固化在不溶性纤维上进行血流或血浆灌流，这样既可防止多黏菌素B释入血内，同时又能有效地清除血中的内毒素。动物实验及部分临床应用证明此方法有效。早在1990年，作者就把多黏菌素B固化在葡聚糖载体上进行试验，结果显示，用葡聚糖-多黏菌素B层析柱能有效地清除液体中的内毒素，能完全清除自来水、蒸馏水，0.9%的NaCI溶液、氨基酸液、腹透性等液体中的内毒素且并不影响各液体中的其他成分；能大部分清除血浆及腹水中的内毒素，且对蛋白及其他血浆成分影响极小。实验表明，用多黏菌素B直接血液灌注能保护实验动物免受E.coli内毒素的致死作用。实验性感染性休克和败血症患者经治疗后，血浆内毒素及TNF-α水平明显下降，发热程度下降，血流动力学参数好转（心排血指数、外周血管阻力、心率和血压），血液pH值、血糖、血浆乳酸水平和组织氧化作用等异常明显改善。治疗后患者血中细菌计数减少，这可能是由于内毒素清除后肝脏能更有效地清除血中的细菌，或者是由于血液过滤诱导产生超氧阴离子及调理素来消灭细菌所致。对G+杆菌感染患者的治疗不如对G-杆菌感染患者那样有效。现已证明，用阴离子及纤维蛋白溶解素吸附剂的体外过滤器也能清除内毒素的作用，但吸附能力较差，用活性炭技术吸附血中内毒素及细胞因子有效，且吸附能力大，但因其为非特异性吸附，常还同时吸附体内的许多有效成分，限制了它在临床使用。对多项研究结果的比较发现，多黏菌素B作为配体的直接血流灌注技术比别的方法更有效，更具有特异性吸附血液中的内毒素的作用。最近，在日本已初步应用于临床治疗败血症，结果令人满意。

人体内许多血清蛋白分子具有抗内毒素的功能。这些成分包括脂蛋白（LDL，HDL）、血清淀粉样Р物质（ASP）、急性时相蛋白如LPS结合蛋白（LBP）及粒细胞蛋白如倔强素（indolicidins）、防御素、相对分子质量为18000的阴离子抗菌蛋白（CAP18）、嗜天青蓝素（azurocidin，CAP37>及杀菌渗透性增强蛋白（BPI，CAP57）。各种脂蛋白包括乳糜微粒、VLDL、LDL及HDL，可结合及灭活LPS。对健康志愿者给予HDL可有效地阻止LPS诱导的炎症反应，这可能是由于HDL-LPS复合物形成后可被肝脏清除所致，可溶性CD14可将LPS运送至HDL，也可促使LPS的清除，但也可促进内皮细胞细胞因子的产生。SAP及其13个氨基酸多肽（SA27~39）可以中和LPS；粒细胞蛋白（CAP18）可与LPS结合，并抑制LPS的活性。近来有研究者报道﹐由CAP18的C端LPS结合区域合成的27个氨基酸多肽（CAP18109~135）能保护小鼠免受内毒素的致死作用。但最有希望的血清因子是BPI，因为最近的临床试验结果表明它对内毒素休克的治疗具有良好的效果。BPI是人体蛋白的一种，主要存在于中性粒细胞的颗粒内，由450个氨基酸组成，具有较强的杀菌能力，也能与内毒素脂质A成分相结合。在结构上，BPI类似于LPS结合蛋白，它们约有45%的序列相同。这两种蛋白质对LPS均有较高的亲和力，但在功能上有所不同；BPI抑制效应细胞上的CD14被激活（单核细胞、巨噬细胞及中性粒细胞），从而阻止LPS的作用；而LBP则促进这些效应细胞的活性，增加LPS的生物效应。BPI和LBP在体液中是一对分子拮抗剂，相互竞争与LPS的结合。内毒素的生物作用依赖于这两个内毒素结合蛋白的组织相对浓度。血循环中以LBP占优势，因为这是一个肝细胞合成的急性时相蛋白；在溶液中以BPI占优势，因为中性粒细胞脱颗粒并释出BPI进入炎症部位。近来已明确，BPI是一个三面体结构，形成“V”字形分子，氨基末端与羧基末端平面对称，多个氨基酸形成一个亲水口袋，且能与内毒素的脂质A相结合。BPI对内毒素具有高度的亲和性，能有效地清除循环中的内毒素。重组全蛋白（holoprotein）及相对分子质量为23000的BPI氨基末端部分在治疗内毒素血症及G杆菌败血症中已被证明有效。这种蛋白也具有杀菌特性，能增加各种G-杆.菌外膜的通透性，使许多肠道细菌死亡，因此这些蛋白有杀菌及抗内毒素作用。人类重组BPI的N-末端区域多肽作为一种抗内毒素制剂已在脑膜炎球菌败血症、失血性休克及部分肝切除术患者中进行了广泛的临床试验。结果显示，该制剂能明显减少脑膜炎球菌败血症儿童的病死率。但关键问题是，这种多肽的半衰期短（2～4min），临床应用时需大剂量持续输注才能维持一定的血浓度，起到抗内毒素作用.如果BPI在今后的临床研究中被证实有效，则更多更符合药动学的BPI衍生物将会产生。许多脂蛋白对内毒素有清除作用，但其中HDL对内毒素作用最大。HDL对细菌内毒素具有较高的亲和性，一旦LPS进入HDI颗粒就形成非常稳定的HDL-LPS复合物，后者可被肝清除机制有效地清除。事实上，HDL的功能类似于内源性LPS清除系统，可阻止内毒素血症对人体的有害作用。LPS与HDL之间的结合主要是靠LPS结合蛋白或可溶性CD14的转运作用而实现的。如果HDL的量不足，血中LPS的作用可因HDL的结合作用而减弱。能表达大量人体脂蛋白A（HDL主要蛋白成分）的转基因小鼠能免受内毒素的致死作用。相反﹐脂蛋白A基因敲除小鼠对内毒素高度敏感。临床上，危重患者的HDL浓度往往降低，抗内毒素能力下降，这可能也是造成危重患者易致内毒素血症或败血症的原因之一。如果此时输入外源性HDL则可提供LPS清除物质，对GT杆菌感染者有益。在Ⅰ期临床试验中，在受试者接受内毒素刺激后给予重组HDL，结果显示重组HDL能有效地阻止促炎细胞因子的合成，限制内毒素对血细胞的毒性作用。目前正在设计HDL对腹膜炎患者的Ⅱ期临床试验计划。

用疫苗防止败血症最关键的问题是需要有一个好的抗内毒素疫苗。环磷酰胺与其他化疗药物能通过作用于抑制性T淋巴细胞促进抗体形成。其实小剂量的环磷酰胺常在肿瘤疫苗中使用。Cross等报道，在环磷酰胺诱导产生的白细胞减少出现前6周，应用脱毒J5LPS/脑膜炎球菌B组OMP复合物免疫小鼠，能明显保护小鼠免受铜绿假单胞菌或肺炎克雷伯杆菌所致的致死性败血症。被动免疫最大的不足是抗体不能持续太久，但主动疫苗免疫的抗体形成则可持续3个月以上。研究还发现，急性创伤患者应用多价铜绿假单胞菌和克雷伯杆菌疫苗后，其抗体形成水平也能达到正常人的水平，这与预想中的结果不一致，因为急性创伤患者的巨噬细胞抗原呈递过程已受到损害，可能会影响抗体的形成。但急性创伤时，Tn2细胞因子（IL-4、IL-10）水平可能也有所增加，这些Tn2细胞因子可促进抗体的形成，可弥补巨噬细胞功能的不足。这些资料提示，用一种完全有效的疫苗能预防高危人群（战士、重危患者及手术患者）败血症的发生。败血症期间因体内抗核心糖脂抗体可能已经耗尽，因此对此类患者进行免疫治疗时可加用抗核心糖脂抗体，以增加主动免疫的疗效。研究者发现，临床上心脏手术、骨髓移植的预后与患者体内的内毒素抗体水平有关，内毒素抗体水平低的患者预后较差。尽管这些患者无败血症的证据，但有可能存在着内毒素血症，这是由于应激使肠道通透性增加，发生肠道内毒素转位所致。因此，内毒素抗体可能对这些患者有效。被动免疫可使患者在短时间内提高体内的抗内毒素抗体水平，或通过主动免疫使内毒素抗体的持续时间延长，可预防或治疗败血症以外的情况。总之，内毒素抗体或内毒素疫苗的发展对防治内毒素血症及败血症具有良好的前景。因此，研究安全有效的方法是目前提高抗体及疫苗疗效的关键所在。

许多研究报道了用灭活细菌疫苗主动免疫人体以诱导产生抗核心糖脂抗体，但仅有一个研究中分析了抗体的反应性。结果显示，8/16的疫苗有IgG抗体增加4倍以上，9/16的抗体IgM也有所增加，不过抗体的增加是暂时的，实验30d后再用疫苗不能使抗体增加。研究中所有受试者均有局部反应，7例有一种或更多的全身症状。随着疫苗技术的进展，这种整个细菌的疫苗日趋淘汰，这主要是因为这种疫苗难于保持实验的重复性及易出现副作用。因此，目前只采用亚单位疫苗。以往的研究已表明，与单用J5疫苗免疫兔子比较，用J5LPS共价结合的疫苗免疫兔子后能诱导16～28倍的抗J5抗体（J5-DT）；但用J5LPS与脑膜炎萘瑟球菌B组外膜蛋白（OMP）非共价复合物免疫兔子能产生147~511倍的抗J5LPS抗体，并能有效地保护小鼠免受铜绿假单胞菌败血症的致死作用。纯化的兔抗血清IgG与异种G-杆菌具有交叉反应，从J5LPS分离出来的核心寡糖能抑制（92%）抗J5IgG与J5LPS的结合，而无关的LPS（brucella）则无此抑制作用。这些结果表明，抗体是针对JLPS寡糖结构的，与J5LPS结合疫苗比较，J5LPS隐藏的结构抗原在J5LPS与OMP结合后可暴露出来。这种疫苗已在人体中进行Ⅰ期临床试验。Lugowski等共价结合E.coliR1、R2、R3、J5的寡糖核心（OS）和沙门菌4aRa-TT，并在Freund佐剂中免疫兔子。结果显示，OS-RT1抗血清只与同型核心部分起反应，OS-R2TT抗血清与沙门菌Ra核心结构有交叉反应。OS-J5TT抗血清与R1及R3核心型交叉反应较弱，与R2及Ra核心型的LPS反应较强。OS-R1、R2、R3与Ra-TT结合抗血清与肺炎克雷伯杆菌O3LPS的慢移动部分反应较强，而对快移动部分反应较弱。这些研究提示，上述组合所产生的抗体对E.coli的反应有差异，但至今仍无这些抗体保护作用的报道。

图35-3显示了从蛋白质溶液中吸附内毒素的原理。阴离子交换配体和一切内毒素选择性配体在工作条件下带正电荷网，如此，带负电荷的蛋白质和内毒素在低离子力时被吸附，此时蛋白质和内毒素几乎不能回复。当吸附能力耗尽之后（不取决于是否系内毒素特异性），蛋白质的回复便可接近100%。所采用配体的结合位点的多少对蛋白质和内毒素来讲是一样多的，所以蛋白质和内毒素对这些结合位点的竞争影响了内毒素的清除。同样，对于一些已经被吸附的内毒素来说，在蛋白质浓度比内毒素浓度高出6个数量级的情况下也是可以被取代下来的。另一方面，内毒素和带阳离子电荷网的蛋白质形成复合物以致亲和配体和蛋白质竞争内毒素，如果在吸附剂表面的电荷密度高或者使用一种选择配体，使得平衡倾向于吸附剂，则可使内毒素得到去除。当带阳离子电荷网的蛋白质从阴离子交换剂上解脱时，能得到几乎100%的蛋白质。迄今为止，以上所提及的吸附剂没有一个已被实际用于蛋白质溶液的内毒素清除。但是，离子力起到了重要的作用，特别是在吸附过程的最初阶段。低离子力的物质，相当于小于50mmol/L的NaCl，常被推荐用作离子交换剂。具有较高离子力的物质如多黏菌素B和DAH，在被用作亲和吸附剂时，与配体的结合主要依靠离子间作用力和疏水作用。在合适的条件下，其关系常数超过109。多阳离子配体较少依靠离子力。蛋白质的去污染与其在环境条件下的等电点及pH值稳定性有很大的关系。一般来说，当pH值接近蛋白质的等电点时，内毒素能最大限度地被去除。强碱或强酸性蛋白质的化学特性使其在纯化时发生不可逆的丢失，而且沉淀反应也是一个问题，所以必须寻找一个折中的办法。对于酸性蛋白质而言，环境pH值应该尽可能接近PI，同时应该采用多聚的或疏水性弱的配体。等电点接近7的蛋白质应该在pH≈PI的环境下进行去污染。虽然用内毒素选择性配体能得到更好的结果，但阴离子交换剂也可以采用。离子交换剂对碱性蛋白质的去污染结果也相当不错，特别是带有4条氨基酸基团的配体，它在碱性条件下能显示出较高的离子密度，并在提高pH值后与内毒素的吸附相当匹配。应该注意到，不仅仅是带净电荷的蛋白质，也包括所有阳离子配体，其电荷密度随着pH值的改变会发生变化，但除外那些有4条氨基酸的配体。pH值的升高可导致电荷密度的减少，具体数值可因配体的pK或pI而有差别。如果内毒素和带负电荷的蛋白质之间的作用是由Ca2+介导的，则应该辅以1～5mol/L的EDTA。EDTA是一种强螯合剂，可使蛋白质-Ca2+-内毒素复合物的平衡倾向于解离，由此增进吸附剂的去污效果.此外，如果要采用辅以3-吡喃氨基葡萄糖或其他不带电荷的去污剂，则应事先筛选，因为在应用这些物质时会带来其他问题。评价层析柱在耗尽其蛋白质结合能力之后留在柱里面的内毒素的量是十分必要的，这在部分吸附时也是一样的道理，即蛋白质或内毒素浓度的变化会同时影响到清除效率和蛋白质的回收。 

采用等电点聚集法得到的蛋白质预备成分，可以用一种符合预先测定的等电点的腔隙电解体作为膜来实现。Lncas等发现，这同样能从蛋白质溶液中去除内毒素。肌红蛋白质溶液持续循环于pH 6.98和pH 8.04，1mmol/L HEPES pH 5.1的膜内，在3h之内，内毒素的量从6000ng/L下降到6ng/1。处理其他蛋白质时，可以根据其pI值选用相应的pH 值。这个过程的特点是，需要非常小的离子力来维持一种低电流状态。在锆表面，磷酸和膦酸酯有很大的亲和力，内毒素能被很好地吸附到胶态错上。这些吸附滴的效果在BSA存在下更明显，并且其他能与锆表面有非特异作用的蛋白质也同样可产生这种效果。另外一种内毒素选择性吸附剂以聚葡基葡萄糖交叉连接为基础结构，它们的化学结构是β-1，4-多聚-D-葡萄糖胺。在pH值等于7的条件下，聚葡基葡萄糖带正电荷，同以上提及的其他正电荷配体一样可用于蛋白质的去污染。为了提高在碱性条件下的效果，Kurita Water建议采用四价的聚葡基葡萄糖。Matsumae等于1990年提出从蛋白质溶液中选择性地吸附内毒素也可以用组胺酸固化吸附剂在超过3mol/L的盐浓度下进行，这主要是基于配体的疏水作用。所以，类似的行为也存在于在其他阴性色谱方式下工作的疏水相互作用色谱法所采用的内毒素选择性配体。但是，保留在高盐溶液的蛋白质必须随后被去除，这是一个经济问题。

Minobe等于1991年提出了关于内毒素吸附动力控制的问题，他认为在低浓度时最有特异性，这是由微粒和囊泡的大小及其稳定性所决定的。空间结构的限制阻碍了聚合物穿透吸附剂孔系统。所以，内毒素的吸附主要发生在吸附剂颗粒的外表面，但这只是吸附剂结合能力的一部分，如对于交联葡聚糖珠来说这种作用远小于1%。在孔系统内面的吸附需要分解聚合物，这是一个非常慢的过程，能解释在分批吸附试验中所观察到的摄取曲线扁平的现象。由于大的内毒素结构不紧凑，因而使得它们几乎没有机会与吸附剂产生相互作用，这也是清除因素在动力学方面比用热力学方法检测时低的最为可能的原因。为了克服转运的限制性，吸附剂孔的直径应该超过被吸附的物质的直径。如此，内毒素聚集物的合适孔径应该是超过1μm。当然，吸附也可以发生在某些小颗粒的表面，这些颗粒具有高出于外表面的区域，如高效液相（HPLC）吸附剂，其直径≤5μm，或者是那些非极性的颗粒。但是，此类内毒素选择性吸附剂在市场上尚未有售。另一种替代的办法是以微滤过膜为基础的膜吸附剂，这类膜吸附剂对转运物质量的限制小，可以在花费少的前提下取得较好的通过效果。此种类型的阴离子交换膜在1990年和1996年分别由Hou和Zanienski以及Belanich等提出。当然，另外一些阴离子交换膜也可采用.内毒素选择性配体对多聚体包被的微滤过膜不能通过，表明内毒素从不含蛋白质的溶液中清除时清除因素超过105，在膜内的停留时间是6s。多聚体包被的微滤过膜选择性地吸附带阴离子或阳离子网的蛋白质溶液中的内毒素，同时可以得到几乎100%的纯蛋白质。

Minobe等于1991年提出了关于内毒素吸附动力控制的问题，他认为在低浓度时最有特异性，这是由微粒和囊泡的大小及其稳定性所决定的。空间结构的限制阻碍了聚合物穿透吸附剂孔系统。所以，内毒素的吸附主要发生在吸附剂颗粒的外表面，但这只是吸附剂结合能力的一部分，如对于交联葡聚糖珠来说这种作用远小于1%。在孔系统内面的吸附需要分解聚合物，这是一个非常慢的过程，能解释在分批吸附试验中所观察到的摄取曲线扁平的现象。由于大的内毒素结构不紧凑，因而使得它们几乎没有机会与吸附剂产生相互作用，这也是清除因素在动力学方面比用热力学方法检测时低的最为可能的原因。为了克服转运的限制性，吸附剂孔的直径应该超过被吸附的物质的直径。如此，内毒素聚集物的合适孔径应该是超过1μm。当然，吸附也可以发生在某些小颗粒的表面，这些颗粒具有高出于外表面的区域，如高效液相（HPLC）吸附剂，其直径≤5μm，或者是那些非极性的颗粒。但是，此类内毒素选择性吸附剂在市场上尚未有售。另一种替代的办法是以微滤过膜为基础的膜吸附剂，这类膜吸附剂对转运物质量的限制小，可以在花费少的前提下取得较好的通过效果。此种类型的阴离子交换膜在1990年和1996年分别由Hou和Zanienski以及Belanich等提出。当然，另外一些阴离子交换膜也可采用.内毒素选择性配体对多聚体包被的微滤过膜不能通过，表明内毒素从不含蛋白质的溶液中清除时清除因素超过105，在膜内的停留时间是6s。多聚体包被的微滤过膜选择性地吸附带阴离子或阳离子网的蛋白质溶液中的内毒素，同时可以得到几乎100%的纯蛋白质。

通过内毒素选择性亲和吸附剂来清除内毒素应该是可能的，并能保证蛋白质几乎100%回收。为了清除不同细菌和菌株来源的内毒素，所采用的吸附剂必须与内毒素的化学结构能较好地匹配，所以应选用针对内毒素共有基团的选择性亲和配体，以识别内毒素的保守结构成分，这对于那些未知种类的内毒素大多也是可以成功的。1.多黏菌素B多黏菌素B的抗菌活性针对革兰阴性细菌，通过插入细菌的细胞壁，降解破坏细菌胞壁，其表面的活性环行肽能打破内毒素聚合物。由于多黏菌素B和脂质A之间能相互作用，所以它是一个能识别不同来源内毒素的基团选择性配体。在各种被污染的革兰阴性细菌培养滤液中（1～10mg/L），用多黏菌素B作为吸附配体，清除因素超过105。Talmadge和Siebert对此进行了分批试验，结果显示在有10g/L的BSA或人IgG存在情况下输入6000~6700EU/ml（≈0.6～0.7mg/L）浓度的内毒素，使接触时间为16h，其清除因素大约为103左右，且只能在此水平上下轻微改变。而对不同的单克隆抗体溶液，内毒素的清除因素明显不同。如抗马过氧化物酶抗体和抗人绒毛膜促性腺激素抗体（浓度分别为2.1g/L对20EU/ml内毒素和0.5g/L对61EU/ml内毒素），在20mmol/L磷酸缓冲液（pH6.5）中，内毒素分别被清除到0.3EU/ml和6EU/ml，清除因素分别约为100和10。有研究者报道，从小牛过氧化氢酶中清除内毒素的清除因素超过1000。内毒素血症患者的血浆也可以用此方法，洗脱下来的物质主要是具有神经毒性和肾毒性的多黏菌素B以及单核细胞刺激释放的IL-1。此外，在流经多黏菌素B层析柱时蛋白质也会丢失，比如过氧化氢酶丢失24%，BSA丢失20%。这是由于这些配体具有阳离子特性而与带负电荷的蛋白质发生电荷间相互作用的结果，这也是为什么即使从DNA质粒预备物中可去除200～10000倍的内毒素而DNA的回收率却仅约50%的原因。2.组胺和组胺酸早在1968年Kanoh等就曾将组胺和组胺酸用作了配体，他们发现，核苷酸和内毒素间有相互作用。后来，在1982年，Minobe等也发现除腺嘌呤、胞喀啶等核苷酸碱基外，组胺和组胺酸也能同样成功地使内毒素从各种微生物培养过滤液中去除。虽然，组胺是一种良好的吸附剂，但它们随后转变成组胺酸时才真正具备生物活性。组胺和组胺酸用作内毒素的吸附剂与多黏菌素B同样能有效对各种蛋白质溶液进行去污染，包括血清白蛋白、胰岛素、溶菌酶、肌红蛋白和另外一些清除因素在5～200（主要因蛋白质含量和环境条件而异）之间的物质。1990年，Matsumae等报道了有关分别检测产物回收情况和内毒素去除情况的数据，发现在与多黏菌素B同时存在时，不能很好地独立检测到蛋白质的恢复和内毒素的去除情况。其他实验室的数据显示，蛋白质的存在对于内毒素的去除有很大的影响，比如在有BSA存在的时候，内毒素的清除因素减少超过10倍以上；在有鼠IgG1（PI=5.5）存在的情况下，如果是在中性环境里，清除内毒素根本就无效。同样，缓冲盐溶液对清除效果也是有一定影响的。Minobe等采用了各种配体进行内毒素的清除，虽然它们的去除效果相似，但化学结构却十分不同。他们认为，内毒素结合的机制可归因于疏水作用和电荷作用的协同，主要是具有腔隙（space）的二氨乙烷（DAH）和咪唑的作用。组胺和组胺酸在这种吸附功能下并不必要。DAH腔隙自身也是有效的吸附物质，在一种以聚乙烯醇（PVA）为基础的膜系统支持下，对含有1130EU/ml内毒素的10%细胞色素c溶液和含85EU/ml内毒素的20%HAS溶液去污染，内毒素分别被去除5000倍和100倍。另外，有人也证实DAH和其他一些二氨链烷类对内毒素的有效吸附是由于离子间作用和疏水作用协同起作用的，但他们没有提供有关从蛋白质溶液中清除内毒素的数据。Petsch等于1997年发现，组胺酸配体的功能与其咪唑环上所带的正电荷有关。如果在一个不带正电荷的环氧乙烷谙腔隙混合情况下，只有在pH值≤5的时候才有明显的清除效果，此时咪唑环已被解离（pKI=6.0）。3.多阳离子配体从分子动力学方面来看，与蛋白质相比，有三维结构的内毒素是相当稳定的，这在吸附过程中起到关键性的作用。有资料显示，虽然吸附在0.5mol/L的NaCl溶液中被有效抑制，但仍有一小部分内毒素在高盐浓度环境下（浓度>1mol/L的NaCl溶液）被吸附。配体和内毒素由于长距离的电荷作用而随后产生短距离的相互作用是可能发生的。次级结合是在内毒素改变结构以适合于吸附剂表面的超微结构后通过另外的范德华力和氢键而实现的。用作内毒素吸附的吸附剂只有在某种严格的条件下（30%的乙醇加上1mol/LNaOH）才能成功地被清洁。这一点提示，在亲和配体和内毒素之间准确的结构匹配并不必要。由此可见，内毒素选择性配体应与多离子分子疏水部分的特性相符合。事实上，一些阳离子多聚体已成功地被用作配体（如图35-2）。Mitzner等采用聚乙二胺（PEI）固定在纤维素小滴上，在体外从血清中清除内毒素，与多黏菌素B在生物超级相容性方面有相似的作用。与组胺不固定的纤维相比，PEI不固定在纤维素上，故可较多地从BSA溶液中去除内毒素，此时对离子作用力的依赖较少。肌球蛋白、γ球蛋白和细胞色素c溶液几乎能完全清除内毒素（达95%以上），最终内毒素仅留下≤0.05μg/L，同时有98%的蛋白质可被保存下来。与配体组胺、组胺酸、多黏菌素B和DEAE在一个较高的蛋白质保存水平上相比，多聚L-赖氨酸（PLL）表现出略好的从BSA溶液中清除小量内毒素的能力。与DEAE离子交换相比，PLL吸附剂在蛋白质结合能力耗尽之后仍是有用的。与多聚L-组氨酸（PLH）和多黏菌素B相比，用高相对分子质量的PLL（相对分子质量为150000~300000）预包裹的微板能更好地促进与内毒素的结合。最近，Hirayama等进一步将PLL引入一种多聚基质中从而改变常规用的多聚基质，他们认为可能有更好的效果。Karl等报道，无镐固定的PLH比表面固定有镐的PLH更能促进从BSA溶液中去除内毒素。PLH是一种相当昂贵的配体，在碱性环境（O.1mol/LNaOH）下不稳定。多阳离子与内毒素间相互作用的原理可能与细胞和细胞碎片间的絮凝作用相类似。在絮状沉淀反应开始时，多阳离子-多阴离子复合物形成，然后进行水分子的替代，最后形成絮状物，这个过程也被称为复杂凝聚。如果这个过程也发生于不固定的多聚阳离子和内毒素时，复合物也会从溶液中析出来。这就解释了在这些吸附剂和选择性阳离子配体蛋白质的热力学实验中观察到的其结合位点的高亲和力现象。4.具有阳离予功能基团的聚基质Hirauyama等用了三年的时间发现，通过球形多孔的聚γ-甲基-L-谷氨酸作为吸附剂，比以组胺酸和聚氨基葡萄糖为基础的市售内毒素吸附剂有更强的内毒素结合能力，而且较少依靠离子力（工作范围也相应增加至0.4mol/LNaCl），并对BSA的选择性更好。此外，通过改变反应条件而形成带有小孔的珠状形式可以阻止蛋白质渗透至孔系统，这样便可获得高回收量的带负电荷网的蛋白质，同时内毒素也被强力吸附。作者由此得出结论：高效的内毒素清除能力是由于内毒素聚合物牢固地吸附于吸附剂表面，而BSA与吸附剂的结合能力相当低所致。带电荷的功能性基团固定于侧链上使得酯键的化学活性不稳定是相当不利的，所以原位清除（CIP）在pH值高或低的情况下都不适合。N，N-二甲胺丙腈/N-丙烯胺的应用是近年来新兴起的。改变这两种单体的比例可以调节电荷的密度，或者改变珠形物的孔径都是对内毒素的清除有利的。在溶液pH值=7，μ=0.05的条件下，通常内毒素的去除可以达到96%～99%，0.5g/L BSA中的残余内毒素的量小于1EU/ml，肌球蛋白、γ球蛋白和细胞色素c和其他蛋白质的恢复率达到或超过99%。配体固定于微滤过膜也能形成带阳离子功能基团的多聚体，膜的内侧面（通常是流经孔的壁）最初被一个亲水多聚物如右旋糖苷、羟基纤维素或聚乙烯醇等覆盖。然后，小配体如组胺酸、脱氧胆酸、多黏菌素B或DEAE等，或者是多阳离子配体如PLL或PEI在亲水的多聚物网中失去活动性。整个网络就如阳离子多聚体一样工作，配体相对分子质量的高低并不十分重要。虽然这些膜吸附剂具有阳离子特性，能够吸附带阴离子网的蛋白质，但是在蛋白质结合能力耗尽之后并未发现与配体PEI、PLL，甚至DEAE所结合的内毒素被取代下来。相应的吸附等温线显示出内毒素和蛋白质独特的结合位点。在理想的环境条件下，由于配体对蛋白质的结合力弱，蛋白质的回收率几乎接近100%。采用配体的内毒素去除法较少依赖溶液的pH值和离子力，例如，血清白蛋白溶液在中性条件下能不受蛋白质在此pH值时变为带负电荷的影响而仍有较好的纯化效果。

吸附技术常被用于从蛋白质溶液中清除内毒素，其原理基于活性炭或其他吸附材料的非选择性吸附作用。这用于血浆的去污染是可能的。但是，如果也用非选择性吸附剂来使蛋白质溶液去污染则是不可行的，因为此时蛋白质也会被活性炭不可逆地吸附掉。在医用方面，去除50%的内毒素已被认为是相当成功的，此时很大一部分患者能生存下来，否则将死亡。相反，在生物技术中50%的清除率是绝对不够的，应该将内毒素清除到接近最低下限值。接下来介绍选择性清除内毒素的方法：吸附技术之离子交换层析。内毒素是带负电荷的，采用离子交换法能将其从不含蛋白质的溶液中吸附掉，如二乙烯氨乙烷（DEAE）色谱基质、DEAE膜或带四个氨基酸基团的功能性基质。通过这种方法可以获得超过5个规定量的清除因素，但是，这样的有效去除效率只出现在高内毒素浓度情况下（LPS>1mg/L）。如果初始内毒素浓度≤μg/L（这是内毒素的一般污染水平），则3~4个规定量的减少是可行的。预先需要的最大吸附是初始的低离子力，与之相应的是浓度小于50mmol/L的NaCl溶液。在酸性蛋白质溶液的去污染，由于蛋白质与内毒素竞争吸附剂的结合位点，使蛋白质同时被吸附成为一个难以解决的问题，所以内毒素的浓度通常要达到超过吸附柱对蛋白质的结合能力并使之耗尽的程度，常以DEAE吸附剂BSA作为典型的蛋白质。从这一点来看，只有具有正电荷网的蛋白质如碱性蛋白质，适合于用离子交换法来处理，因为离子交换技术通常是负离子交换模式，从而使这些蛋白质被拒于离子交换基质之上.此时离子交换剂和带正电荷的蛋白质对内毒素的竞争也会发生，使出现沿层析柱分布的内毒素与碱性蛋白质的线性积聚现象。调节酸性蛋白质的pH值使之达到或低于等电点是完全可行的。这样可中和或转换蛋白质的电荷以抑制其被吸附，从而阻止竞争，但这在等电点时对于溶解性好和稳定性好的蛋白质来说则受到限制。一旦内毒素的正电荷网建立，内毒素就能跟碱性蛋白质聚合。

通过添加去污剂，可干扰蛋白质和内毒素之间的相互作用，使层析的效果得以提高。同样，去污剂也能用于双相抽提法，内毒素可通过脂质A的碱性链与去污剂发生非极性作用而从水相中分离出来。三硝基甲苯系列的去污剂在水溶液中具有一种融合性空隙，在某一称为“云点（cloud point）”的关键熔度时，微团聚合成含水量少的小滴从而形成一种新的相态。内毒素被保留在富含去污剂的那一相里。之后通过离心或加热，这两相分离，富去污剂层在底部。如果有必要的话，这个过程可以一直重复，直至内毒素浓度达到下限值以下。三硝基甲苯X-114的云点是22℃，这在纯化蛋白质时是有利的。含内毒素的蛋白质溶液一般冷藏于4℃的温度下，实现两相分离时的温度大于22℃。三硝基甲苯X-110的云点是75℃，这对大多数蛋白质是不适合的。用其他技术从克雷伯杆菌I-714中分离内毒素和外毒素比用两相清除法更为困难。Adam等采用三硝基甲苯X-114进行两相分离前后内毒素浓度相差100倍，最终的内毒素量为30EU/mg，脂多糖的生物活性丢失50%。Cotton等的结果与此相似，大约100倍的内毒素从质粒DNA中被清除，最终的内毒素含量是0.1EU/6ug DNA。此外，他们采用多黏菌素B作为吸附剂取得更好的效果。Liu等也使用三硝基甲苯X-114双相抽提法（图35-1）和亲和吸附剂对重组蛋白质如心肌钙蛋白Ⅰ肌红蛋白和肌酸激酶同工酶的去内毒素污染进行了验证。他们得出结论，相分离是最有效的方法，可以清除内毒素达98%~99%，最终的残留量为2.5～25EU/mg不等，具体因蛋白质的不同而异。由于总有一定量的去污剂残留在蛋白质溶液中，这就需要用吸附活凝胶渗透层析法将其去除，而这又造成了10%～20%的产物丢失，且由于总要重复多次而费时费力。温度的波动使得一次进行大规模的操作有困难，而且这样又限制了那些生物多聚体分割成水相，特别是对于疏水的蛋白质和DNA来说。

避免任何微生物污染及其内毒素释放的最有效而安全的方法是在生产和运输过程中保持绝对的无菌。如果采用某种去污染措施，必须保证得到足够的终产物。Anspach等积累多年的经验总结出，从含蛋白质溶液和不含蛋白质的溶液中去除内毒素是有很大区别的。对于不含蛋白质的溶液，可采用那些利用内毒素与水、盐和其他一些小分子物质的分子大小不同来去除内毒素的方法。下面介绍选择性清除内毒素的方法之超滤法。凝胶过滤色谱法能从无蛋白质的溶液中去除80%以上的内毒素活性。超滤类似于血透，是用一种相对分子质量大约为10000的膜，通常所用的水是超纯水，整个操作系统使用的仪器均为没有内毒素污染的无菌设备。另外，在这种条件下内毒素主要以聚集物的形式存在，所以更加安全可靠。但是需要注意的是，虽然这是一个缓慢的过程，然在温度较高（～100℃）或酸性环境下（pH3.5～4.5）时，部分内毒素分子被分解，从而使内毒素分子的实际毒性部分脂质A（相对分子质量2000~4000）大量释放出来，给内毒素的去除带来麻烦。超滤法也可将内毒素从相对分子质量小的产物溶液中去除，如葡萄糖、盐、许多化学物和不能透过射线的物质以及大多数抗生素等。相对分子质量为10000的膜也可用于此，产物通过膜弥散的同时内毒素却被膜扣留。为了使蛋白质产物也能顺利弥散出来，膜的孔径必须大于相对分子质量100000的蛋白质的直径。在蛋白质存在的情况下，内毒素聚合物分离而成为较小的单体，正如在EDTA或胆酸存在的情况下一样，内毒素单体和蛋白质在大小上相接近，两者均能通过超滤膜。1998年，Li和Luo找到了一个提高蛋白质分离度的方法，他们在含85mmol/L血红蛋白和5mol/ml内毒素的溶液中加入45mmol/L的Ca2+以改变内毒素溶液的结构，使之成为大的聚合体从而减少内毒素量至6ng/L。用相对分子质量为300000的超滤膜可以使血红蛋白透过。但是这种方法对于那些溶解度受高Ca2+浓度影响小的蛋白质来说，使用价值有限。

内毒素与其他物质包括蛋白质能发生许多相互作用。抗内毒素抗体和蛋白质性质的内毒素受体（如CD14、CD16、CD18等）与内毒素之间相互作用并以分子识别的方式实现。另外，还有些蛋白质如溶酶体、乳铁蛋白和转铁蛋白也是与内毒素关系密切的蛋白质（PI>7）。电荷的作用是主要的驱动力。内毒素在与中性蛋白质（如血红蛋白）甚至酸性蛋白质之间的相互作用还必须有其他的机制存在，这种作用即使在低离子强度时也能发生。但关于这方面的研究还有争议，David等认为这可能与血浆白蛋白的脂肪酸结合有关。一般来说，蛋白质的疏水作用是容易理解的，但仍缺乏强有力证据证明这是相互作用的主要机制。与Ca2+有关的蛋白质羧基结合位点和内毒素偏磷酸基结合位点的竞争在蛋白质和内毒素之间形成稳定的钙桥可能性更大。不管这些机制是否重要，事实总是由于这种相互作用使得内毒素分子得以被掩饰而不能被清除。1987年，Karplus等采用多黏菌素B交联葡聚糖作为吸附剂，按标准步骤对小牛过氧化氢酶进行去污染，但并未能达到内毒素的低限。Petsch等在另一项研究中发现，从碱性蛋白质中去除少量内毒素比从酸性蛋白质中去除更难。由于蛋白质与内毒素的相互作用，从蛋白质溶液中去除内毒素需要一种能与内毒素作用更强的技术如吸附层析法。如能找到一种特殊分离蛋白质和内毒素复合体的方法也能有助于去除内毒素分子，且不失为上述这种方法的替代方法。Karplus 等于1987年采用表面活性物质β-辛基吡喃葡萄糖来分离人的IgG-内毒素复合体，并且辅以多黏菌素B交联葡聚糖来吸附内毒素，但是这带来了另一个问题，即如何去除残余的表面活性剂。