选择性清除内毒素的方法之双相抽提法

通过添加去污剂，可干扰蛋白质和内毒素之间的相互作用，使层析的效果得以提高。同样，去污剂也能用于双相抽提法，内毒素可通过脂质A的碱性链与去污剂发生非极性作用而从水相中分离出来。三硝基甲苯系列的去污剂在水溶液中具有一种融合性空隙，在某一称为“云点（cloud point）”的关键熔度时，微团聚合成含水量少的小滴从而形成一种新的相态。内毒素被保留在富含去污剂的那一相里。之后通过离心或加热，这两相分离，富去污剂层在底部。如果有必要的话，这个过程可以一直重复，直至内毒素浓度达到下限值以下。三硝基甲苯X-114的云点是22℃，这在纯化蛋白质时是有利的。含内毒素的蛋白质溶液一般冷藏于4℃的温度下，实现两相分离时的温度大于22℃。三硝基甲苯X-110的云点是75℃，这对大多数蛋白质是不适合的。

用其他技术从克雷伯杆菌I-714中分离内毒素和外毒素比用两相清除法更为困难。Adam等采用三硝基甲苯X-114进行两相分离前后内毒素浓度相差100倍，最终的内毒素量为30EU/mg，脂多糖的生物活性丢失50%。Cotton等的结果与此相似，大约100倍的内毒素从质粒DNA中被清除，最终的内毒素含量是0.1EU/6ug DNA。此外，他们采用多黏菌素B作为吸附剂取得更好的效果。Liu等也使用三硝基甲苯X-114双相抽提法（图35-1）和亲和吸附剂对重组蛋白质如心肌钙蛋白Ⅰ肌红蛋白和肌酸激酶同工酶的去内毒素污染进行了验证。他们得出结论，相分离是最有效的方法，可以清除内毒素达98%~99%，最终的残留量为2.5～25EU/mg不等，具体因蛋白质的不同而异。

由于总有一定量的去污剂残留在蛋白质溶液中，这就需要用吸附活凝胶渗透层析法将其去除，而这又造成了10%～20%的产物丢失，且由于总要重复多次而费时费力。温度的波动使得一次进行大规模的操作有困难，而且这样又限制了那些生物多聚体分割成水相，特别是对于疏水的蛋白质和DNA来说。