游离脂肪酸(FFA)含量检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂一:实验前一天,取一个玻璃瓶,按照正庚烷:无水甲醇:氯仿=24:1:25 的比例配置(自备),盖紧后混匀;
2、 试剂三:临用前每瓶加入 13 mL 无水乙醇充分溶解,4℃可保存一周;
3、 标准品:临用前把试剂转移到 10 mL 玻璃瓶中,加入 7.8 mL 氯仿充分溶解,即为 5μmol/mL 的棕榈酸标准溶液,4℃保存。
产品说明:
FFA既是脂肪水解的产物,又是脂肪合成的底物。血清中FFA的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关。
FFA与铜离子结合形成脂肪酸铜盐,并溶于氯仿;利用铜试剂法测定铜离子含量,即可推算出游离脂肪酸含量。
技术指标:
检出限:0.0390 μmol/mL
线性范围:0.05-2 μmol/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
研钵/匀浆器、冰、台式离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、一个 50mL玻璃瓶、一个 10mL 玻璃瓶、正庚烷、无水甲醇、氯仿(三氯甲烷)、无水乙醇和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、血清中 FFA 测定:将所取血液,室温静置 1 h 后,于 4 ℃ 离心机 3500 rpm 离心 15min,取上层血清置于4℃冰箱保存,待测。
2、组织中 FFA 含量测定:组织用生理盐水冲洗干净后,用吸水纸吸取表面水分,称取约 0.1g,加入 1 mL 提取液,匀浆后,8000rpm,4℃离心 10min,取上清液,置冰上待测。
二、操作步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 550 nm,无水乙醇调零。
2. 试剂二在 37℃水浴中预热 30 min 以上。
3. 标准品的稀释:将标准品用氯仿稀释成 1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05μmol/mL。
4. 按下表在 1.5mL 离心管中加入相应试剂
三、FFA 含量计算
1、标准曲线的绘制:以标准溶液的浓度为x轴,以ΔA标准(ΔA=A标准管-A空白管)为y轴,绘制标准曲线,得到方程y=kx+b。将ΔA(ΔA=A测定管-A对照管)带入方程得到x。
2、血清FFA含量:
FFA含量(μmol/L)=1000x
3、组织FFA含量:
(1) 按样本蛋白浓度计算
FFA含量(μmol/mg prot)=x×V样总÷(Cpr×V样总)=x÷Cpr
(2) 按样本质量计算
FFA含量(μmol/g 质量)=x×V样总÷W
V样总:上清液总体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;1000:单位换算系数,1L=1000mL。
注意事项:
1. 试剂三配制应尽量晚配,可在操作到加入试剂二时,再配制试剂三。
2. 必须保证每管的震荡频率及时间一致。
3. 尽量在 30min 内完成测量。
4. 上层溶液不可以直接加入到 96 孔板内,并且测完后要密封好再丢弃。
5. 因所用试剂多数为有机溶剂,同一支吸头多次吸取会造成体积不准确,建议更换吸头。
实验实例:
1、 取小鼠血清进行样本处理,按照测定步骤操作,使用 96 孔板测得 A 对照管=0.098、A 测定管=0.308、ΔA=A测定管-A 对照管=0.308-0.098=0.21,带入标准曲线 y =0.6679x+0.019,计算 x=0.286,按血清含量计算:
FFA 含量(μmol/L)=1000x=1000×0.286=286 μmol/L。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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