植物中脂氧合酶(LOX)活性检测试剂盒 微量法

植物中脂氧合酶（LOX）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀。

产品说明：

 LOX 广泛存在于植物组织中，特别是黄豆种子中。LOX 催化不饱和脂肪酸氧化反应，导致膜脂过氧化。在植物的生长发育、成熟衰老及逆境胁迫过程中具有重要作用。

LOX 催化亚油酸氧化，氧化产物在 234nm 处有特征吸收峰；测定 234nm 吸光度增加速率，来计算 LOX 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

 研钵/匀浆器、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

称取约 0.1g 样本，加提取液 1mL，冰上充分研磨，16000g 4℃离心 20min，取上清液置冰上待测。

二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 234nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一在 25℃水浴中预热 30min 以上。

3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水、160μL试剂一和20μL试剂二，迅速混匀后于234nm比色，记录 15s 和 75s 的吸光值，分别记为 A1 和 A2。空白管只需做 1-2 次

4. 测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL试剂一和20μL试剂二，迅速混匀后于234nm比色，记录 15s 和 75s 的吸光值，分别记为 A3 和 A4。

三、LOX 活性计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在 1mL 体系下，25℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为一个酶活单位。

LOX (U/mg prot) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷0.001÷(Cpr×V 样)÷T×V 反总=10000×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷Cpr

2. 按样本质量计算

活性单位定义：在 1mL 体系下，25℃中每克样本每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为一个酶活单位。

LOX (U/g 质量) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷0.001÷(V 样÷V 样总×W)÷T×V 反总=10000×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷W

 Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL（需另外测定）；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V 样总：上清液总体积，1mL；T：反应时间，1min；V 反总：反应总体系，0.2mL。

b.使用 96 孔 UV 板测定的计算公式如下

3. 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在 1mL 体系下，25℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化 0.0006 个单位为一个酶活单位。

LOX (U/mg prot) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷0.0006÷(Cpr×V 样)÷T×V 反总=16667×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷Cpr

4. 按样本质量计算

活性单位定义：在 1mL 体系下，25℃中每克样本每分钟催化吸光值变化 0.0006 个单位为一个酶活单位。

LOX (U/g 质量) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷0.0006÷(V 样÷V 样总×W)÷T×V 反总=16667×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷W

 Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL（需另外测定）；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V 样总：上清液总体积，1mL；T：反应时间，1min；V 反总：反应体系总体积，0.2mL。

注意事项：

1．样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日完成酶活性测定。

2．正式实验前做 1~2 个预实验，保证?A 的值在 0.02~1.2（微量石英比色皿）/0.01~0.72（96 孔板）范围内；若反应后为明显的悬浊液，则需稀释后再测。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！